CRISPR) የሶስተኛ ትውልድ የጂኖም አርትዖት ቴክኒክ ነው፡ CRISPR ዓለምን አብዮት ፈጥሯል

በተደጋጋሚ የተጠላለፉ አጭር የፓሊንድሮሚክ ድግግሞሽ (CRISPR) ዓለምን በከፍተኛ የውጤት ውጤቶቹ አብዮት ያደረገ የሶስተኛ ትውልድ የጂኖም አርትዖት ዘዴ ነው። የተለያዩ ባዮሎጂያዊ በሽታዎችን እና ኢንፌክሽኖችን ለማከም ጥቅም ላይ ውሏል። የተለያዩ ባክቴሪያዎች እና ሌሎች ፕሮካርዮቶች (እንደ አርኬያ ያሉ) እንዲሁም ከፋጂዎች ለመከላከል የCRISPR/Cas9 ስርዓቶች አሏቸው። CRISPR/Cas9-ተኮር ስልቶች ሊለወጡ የሚችሉ የመቋቋም ጂኖችን፣ ግልባጭን እና ኤፒጄኔቲክ ቁጥጥርን በማነጣጠር የሶስትዮሽ አሉታዊ የጡት ካንሰር (TNBC) እድገትን እና እድገትን ሊገቱ እንደሚችሉ ተዘግቧል። እነዚህ የሕክምና ጣልቃ ገብነቶች በTNBC ውስጥ እንኳን የሚታዩትን የመድኃኒት መቋቋምን ያሉ ፈታኝ ችግሮችን ለመፍታት ሊረዱ ይችላሉ። በአሁኑ ጊዜ CRISPR/Cas9ን ወደ ዒላማ ሴሎች ለማድረስ የተለያዩ ዘዴዎች ጥቅም ላይ ይውላሉ፣ ለምሳሌ አካላዊ (ማይክሮኢንጀክሽን፣ ኤሌክትሮፖሬሽን እና ሃይድሮዳይናሚክ ሁነታዎች)፣ ቫይራል (አዴኖ-ተያያዥ ቫይረስ እና ሌንቲቫይረስ) እና ቫይራል ያልሆኑ (ሊፖሶሞች እና ሊፒድ ናኖፓርቲክሎች)። )-ቅንጣቶች)። የTNBC ሞለኪውላዊ መንስኤዎችን ለማጥናት የተለያዩ ሞዴሎች ቢዘጋጁም፣ በቪቮ ውስጥ የጂኖም አርትዖት መሳሪያዎችን ለማቅረብ ስሜታዊ እና የታለሙ ዘዴዎች አለመኖር ክሊኒካዊ አተገባበራቸው ላይ ገደብ ጥሏል። ባጭሩ፣ ይህ ግምገማ ለTNBC የCRISPR/Cas9 ሕክምና እድገትን፣ ተግዳሮቶችን፣ ገደቦችን እና ተስፋዎችን በተሟላ ሁኔታ ይመረምራል። እንዲሁም የአርቴፊሻል ኢንተለጀንስ እና የማሽን ትምህርት ጥምረት በTNBC ሕክምና ውስጥ የCRISPR/Cas9 ስልቶችን እንዴት ሊያሻሽል እንደሚችል እናጎላለን።
ካንሰር ቁጥጥር ያልተደረገበት የሴል ክፍፍል፣ የሴል ዑደት ፍተሻዎች መስተጓጎል እና በቲሞር አፋኝ ጂኖች ውስጥ በሚውቴሽን (TSGs) ይታወቃል (ማቲውስ እና ሌሎች፣ 2022)። ከተለያዩ የካንሰር ዓይነቶች መካከል የጡት ካንሰር በሴቶች ላይ በጣም የተለመደ የካንሰር አይነት ሲሆን በዓለም አቀፍ ደረጃ ከፍተኛ የሞት መጠን አለው (ዋክስ እና ዊነር፣ 2019)። የጡት ካንሰር እንደ ሂስቶሎጂካል እና ባዮሎጂካል ባህሪያት፣ ክሊኒካዊ አቀራረብ እና ባህሪ እና ለህክምና ምላሽ ያሉ የተለያዩ ባህሪያት ያሉት የተለያዩ በሽታዎች ያሉት በሽታ ነው። የጡት ካንሰር ምደባ ለጡት ካንሰር ምርመራ እና ለቲሞር ትንበያ ትክክለኛ ግንዛቤዎችን ይሰጣል። የተለመዱ ባዮማርከሮችን እና ክሊኒካዊ የፓቶሎጂ ባህሪያትን መጠቀም የጡት ካንሰርን ለመመደብ ዋናው መስፈርት ነው (Tsang እና Tse፣ 2019)። ለጡት ካንሰር ሕክምና ትንበያ እና ምላሽ በብዙ ምክንያቶች ተጽዕኖ ይደረግበታል፣ ከእነዚህም ውስጥ የኢስትሮጅን ተቀባይ (ER)፣ የፕሮጄስትሮን ተቀባይ (PR)፣ የሰው ኤፒደርማል የእድገት ፋክተር ተቀባይ 2 (HER2/neu) እና ሂስቶሎጂካል ደረጃ፣ የቲሞር አይነት እና ደረጃ ይገኙበታል። መጠን እና የሊምፍ ኖድ ሜታስታሲስ (አል-ቱባይቲ፣ 2020)። አምስት ውስጣዊ ሞለኪውላዊ የጡት ካንሰር ዓይነቶች ተለይተዋል፣ እነሱም ሉሚናል ኤ፣ ሉሚናል ቢ፣ HER2-የበለፀገ፣ ቤዛል-መሰል እና ክላውዲን-ሎው (ፕራት እና ሌሎች፣ 2015)። TNBC ሁሉንም ER፣ PR እና HER2 የማይገልጽ ሞለኪውላዊ የካንሰር ንዑስ አይነት ነው (ዪን እና ሌሎች፣ 2020)። እነዚህ የፓቶሎጂ ባህሪያት ከTNBC ጋር የተቆራኙ ሲሆኑ፣ ፈጣን እድገቱን እና ከማንኛውም የጡት ካንሰር አይነት የበለጠ ጠበኛ ባህሪውን ያረጋግጣሉ (ፌንግ እና ሌሎች፣ 2018)። በተጨማሪም፣ ፔሩ እና ሌሎች (2000) የጡት ካንሰርን እንደገና ለመመደብ እና አምስት ውስጣዊ የጡት ካንሰር ዓይነቶችን ለመለየት ማይክሮአሬይ ቴክኖሎጂን ተጠቅመዋል (ካዴናስ፣ 2012)። ቤዛል-መሰል የጡት ካንሰር ሶስትዮሽ አሉታዊ phenotype ያለው እና ከፈጣን እድገት ጋር የተቆራኘ የጡት ካንሰር ንዑስ አይነት ነው። ሁሉም መሰረታዊ የሚመስሉ የጡት ካንሰሮች በተለምዶ TNBC ተብለው በስህተት እንደሚታወቁ ልብ ሊባል ይገባል፣ ነገር ግን 77% የሚሆኑት ብቻ TNBC ናቸው፤ በተቃራኒው፣ ከ71-91% የሚሆኑት TNBC መሰረታዊ የሚመስሉ ሲሆኑ፣ እነዚህ ሁለት የጡት ካንሰር ዓይነቶች እርስ በርስ እንደሚደራረቡ እና የተለያዩ ምደባዎችን እንደሚወክሉ ያሳያል (ዋንግ ዲ.-ዋይ. እና ሌሎች፣ 2019)። ይህ ትንበያን ለማብራራት እና ለአሁኑ እና ለወደፊት ሕክምናዎች ሊሆኑ የሚችሉ ምላሾችን ለመለየት የTNBC ልዩነትን የመለየት አስፈላጊነት ይፈጥራል። በተጨማሪም፣ TNBC ከሁሉም የጡት ካንሰር ጉዳዮች 15-20% የሚሆነውን ይይዛል እና ከ50 ዓመት በታች በሆኑ ሴቶች ላይ የተለመደ ነው። የBRCA1 ወይም የBRCA2 ሚውቴሽን በግምት 20% የሚሆኑት የTNBC ጉዳዮች ላይ ሪፖርት ተደርጓል (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017)., 2020)። ጥናቶች እንደሚያሳዩት TNBC ከፍተኛ የደም ሥር ኢንዶቲየል እድገት ምክንያቶችን፣ ከቲሞር ጋር የተያያዙ ማክሮፋጆችን (TAMs)፣ ቲሞር-ኢንሰርትራቲንግ ሊምፎይኮችን (TILs) እና በቲሞር እድገትና ፍልሰት ውስጥ የተሳተፉ ሌሎች ሞለኪውሎችን የሚያካትት የተለየ የበሽታ መከላከያ ማይክሮአካባቢ አለው። ስለዚህ፣ የTNBCን ማይክሮአካባቢ መረዳት ለትንበያ እና ለህክምናው ወሳኝ ነው (Fan and He, 2022)።
የTNBC ትንበያን ለመገምገም እና ውጤታማ ህክምናን ለማረጋገጥ፣ በዋነኛነት በኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ (IHC) ላይ የተመሠረተ ትክክለኛ ምርመራ፣ ER፣ PR እና HER2 ን ለመለየት እና የጡት ኒዮፕላዝሞችን ለመለየት ማሞግራፊ አስፈላጊ ነው። ሆኖም፣ ማሞግራፊ እንደ ኒክሮሲስ እና ፋይብሮሲስ ያሉ የውስጥ ዕጢ ባህሪያትን በበቂ ሁኔታ ማሳየት አይችልም (ዲፓክ ሲንግ እና ሌሎች፣ 2021)። ደካማ ትንበያ እና ምርመራ ዶክተሮች ትክክለኛ መድሃኒቶችን እንዳያዝዙ ስለሚያግዳቸው (Chaudhary, 2020)፣ TNBC ላላቸው ታካሚዎች እንክብካቤን ለማሻሻል የተለያዩ ስልቶች ጥቅም ላይ ይውላሉ። በአሁኑ ጊዜ፣ ሁለት መድኃኒቶች፣ ዶክሶሩቢሲን እና ሳይክሎፎስፋሚድ፣ በTNBC በሽተኞች ላይ ጥቅም ላይ ይውላሉ እና ጥሩ ውጤቶችን አሳይተዋል። በተጨማሪም፣ እንደ ካርቦፕላቲን እና ሲስፕላቲን ያሉ ሌሎች የፕላቲነም መድኃኒቶች ጥቅም ላይ ይውላሉ (ሲኮቭ እና ሌሎች፣ 2015)። በተጨማሪም፣ እንደ ኦላፓሪብ፣ ቬላፓሪብ እና PF-01367338 ያሉ የPARP አጋቾች ለTNBC ሕክምና እንደ እምቅ የኬሞቴራፒ መድኃኒቶች ሆነው አገልግለዋል (Ishino et al., 2018)። የWnt/b-Catenin፣ NOTC እና Hedgehog ምልክት ማድረጊያ መንገዶች በTNBC መከሰት እና እድገት ውስጥ እንደሚሳተፉ ሪፖርት ስለተደረገ፣ ለእነዚህ መንገዶች መድኃኒቶችን ማነጣጠር አስፈላጊ ስትራቴጂ ሊሆን ይችላል (Aysola et al., 2013)። ምንም እንኳን ቀዶ ጥገና፣ የጨረር ሕክምና እና የኬሞቴራፒ ሕክምና ዛሬ ለTNBC የሕክምናው ዋና መሠረት ሆነው ቢቀጥሉም፣ የታለመ ሕክምና፣ የበሽታ መከላከያ ሕክምና፣ እንደ Cas9n፣ dCas9.፣ CRISPR/Cas12፣ ዋና አርትዖት እና CRISPR/Cas9-ዒላማ የተደረገ የጂን ሕክምናን ጨምሮ አዳዲስ ሕክምናዎችን በማዘጋጀት ረገድ ጉልህ እድገት ታይቷል። እዚህ ላይ በTNBC ሕክምና ውስጥ ጥቅም ላይ በሚውሉ የተለያዩ CRISPR-ተዛማጅ የጂን አርትዖት መሳሪያዎች ላይ እናተኩራለን። ከእነዚህም መካከል CRISPR/Cas9 ሰፊ ትኩረት አግኝቷል።
Cas9n፣ እንዲሁም Cas9 ኒካሴ በመባል የሚታወቀው፣ ከCRISPR/Cas9 የጂኖም አርትዖት ስርዓት የተገኘ የCas9 ፕሮቲን በጄኔቲክ የተመረተ ልዩነት ነው (ጉፕታ እና ሌሎች፣ 2019)። በመጀመሪያው መልኩ፣ የCas9 ፕሮቲን ሁለት የኒውክሊየስ ጎራዎችን ይዟል፡ RuvC እና HNH፣ ዋናው ተግባሩ የሁለቱም የዲኤንኤ ክሮች መቆራረጥ ነው። ሆኖም፣ በCas9n ውስጥ፣ ከኑክሊየስ ጎራዎች አንዱ የሆነው HNH፣ በጄኔቲክ ተለውጦ እንቅስቃሴ አልባ ይሆናል። ስለዚህ፣ የCas9n HNH ጎራ ተግባራዊ ያልሆነ ሆኖ ይቆያል። የRuvC ጎራ ብቻ ንቁ ሆኖ ይቆያል፣ ይህም Cas9n በነጠላ የዲኤንኤ ክሮች ላይ ክፍተቶችን እንዲቆርጥ ወይም እንዲፈጥር ያስችለዋል (Trevino እና Zhang፣ 2014)። ከCas9 ጋር ሲነጻጸር፣ Cas9n ከዒላማ ውጪ የሆኑ ውጤቶችን ውጤታማ በሆነ መንገድ ሊቀንስ እና የሕዋስ ጥገና ዘዴዎችን በትክክል ሊያሻሽል ይችላል። Cas9n እንደ ድርብ-ክር ዲኤንኤ ውስጥ በተወሰኑ ቦታዎች ላይ ክፍተቶችን መፍጠር ያሉ የተለያዩ ችግሮችን ለመፍታት ሊያገለግል ይችላል። ለዚህ ዓላማ ሁለት የCas9n ሞለኪውሎች ተጣምረው አንድ ላይ ጥቅም ላይ ውለዋል (Yee, 2016)። የተቀላቀለ የዘር ሐረግ ኪናሴ 3 (MLK3) በTNBC ሜታስታሲስ ወቅት እንደ ቁልፍ ተቆጣጣሪ ሆኖ የሚያገለግል ሚቶጅን-አክቲቭ ፕሮቲን ኪናሴ ነው (ክሮናን እና ሌሎች፣ 2012)።
MLK3 ወደ TNBC ሜታስታሲስ የሚያመሩ በርካታ የምልክት መንገዶችን ማግበር ይችላል። ለምሳሌ፣ የc-Jun N-terminal kinase (JNK) መንገድ የሴል እንቅስቃሴን እና ከሴሉላር ማትሪክስ መበላሸትን ይቆጣጠራል፣ እና MLK3 የJNK መንገድን ያነቃቃል፣ በዚህም የሴል እንቅስቃሴን ያሻሽላል እና ወራሪ ባህሪያትን ይሰጣል (Rattanasinchai እና Gallo, 2016)። MLK3 EMTንም ይቆጣጠራል። ይህንን ለማድረግ እንደ Snail፣ Slug እና Twist ያሉ የታችኛውን የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶችን ያነቃቃል። እነዚህ ምክንያቶች የኤፒተልየል ማርከሮችን አገላለጽ ይከለክላሉ እና የሜሴንቺማል ማርከሮችን አገላለጽ ያበረታታሉ፣ ይህም የሜታስታቲክ ፊኖታይፕ እንዲገኝ ያደርጋል (Casalino et al., 2023)። MLK3 ECMን የሚያበላሹ እንደ ማትሪክስ ሜታሎፕሮቲናሴስ (MMPs) ያሉ ፕሮቲኤሶችን በECM መልሶ ማቋቋም እና በማግበር ረገድ ሚና እንደሚጫወት ታይቷል። ይህም የቲዩመር ሴል ወረራ እና ወደ ሩቅ ቦታዎች እንዲሰራጭ ያመቻቻል (Katari et al., 2019)። ስለዚህ፣ ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች MLK3 በTNBC ውስጥ ወሳኝ ሚና እንደሚጫወት አሳይተዋል። ራታናሲንቻይ እና ጋሎ የMLK3ን ሚና ለማጥናት የTNBC ሞዴሎችን ተጠቅመው የካንሰር እድገትን በተወሰኑ የምልክት መንገዶች እንደሚያበረታታ ደርሰውበታል። MLK3ን ለማረም CRISPR/Cas9nን ተጠቅመው የTNBC ሜታስታሲስ ላይ ከፍተኛ ቅነሳ አሳይተዋል (Rattanasinchai and Gallo, 2016)።
dCas9፣ ብዙውን ጊዜ ንቁ ያልሆነው Cas9 ተብሎ የሚጠራው፣ የተሻሻለው የCas9 ፕሮቲን ተዋጽኦ ነው። ከንቁ Cas9 በተለየ፣ dCas9 የኢንዶኑክሊየስ እንቅስቃሴ የለውም፣ ይህም የዲኤንኤ ድርብ-ክር መቆራረጥን ሊያስከትል አይችልም። ስለዚህ፣ dCas9 በዲኤንኤ ቅደም ተከተል ላይ ምንም አይነት ለውጥ ወይም ማሻሻያ ሳይኖር የተወሰኑ የጂኖም ክልሎችን በትክክል ለማነጣጠር ሊያገለግል ይችላል (ዋንግ እና ሌሎች፣ 2016)። በdCas9 ውስጥ፣ ሁለት የኢንዶኑክሊየስ ፕሮቲኖች፣ RuvC እና HNH፣ አስፈላጊ የሆኑ የአሚኖ አሲድ ቅሪቶችን በመግታት ይቆማሉ። (ሪችተር እና ሌሎች፣ 2016)። የዲኤንኤ መቆራረጥ እንቅስቃሴ ባይኖርም፣ dCas9 በጄኔቲክ ምርምር እና ባዮቴክኖሎጂ ውስጥ በርካታ ጠቃሚ ሚናዎችን ይጫወታል። ለምሳሌ፣ የተወሰኑ የጂኖም ክልሎችን በእይታ እንዲታይ ያስችላል፣ የትራንስክሪፕሽን ቁጥጥርን ያመቻቻል እና የኤፒጄኔቲክ ማሻሻያዎችን ያበረታታል (ብሮከን እና ሌሎች፣ 2018)።
የትራንስክሪፕሽን ፋክተር ZEB1 (ዚንክ ጣት ኢ-ቦክስ ማሰሪያ ሆሚዮቦክስ 1) በፅንስ እድገት፣ በቲሹ ጥገና እና በካንሰር እድገት ወቅት የሚከሰተውን የሴሉላር ሂደት የሆነውን የኤፒተልየል-ሜሴንቺማል ሽግግር (EMT) በማስተባበር ረገድ ልዩ እና ወሳኝ ሚና ይጫወታል። የኤፒተልየል ሴሎችን ወደ ሜሴንቺማል ሴሎች መለወጥን ያካትታል፣ ይህም በሴል ሞርፎሎጂ፣ በእንቅስቃሴ፣ በወራሪነት፣ ወዘተ ላይ ለውጦችን ያስከትላል (Wu et al., 2020)። ZEB1 እንደ E-cadherin እና Occludin ያሉ በርካታ የኤፒተልየል ማርከሮችን ይከላከላል፣ እነዚህም በTNBC ውስጥ የሴል-ሴል ማጣበቂያ እና የኤፒተልየል ሴሎችን ፖላሪቲ ለመጠበቅ ኃላፊነት አለባቸው (Moreno-Bueno et al., 2008)። በተጨማሪም፣ ZEB1 እንደ N-cadherin፣ vimentin እና fibronectin ያሉ የተወሰኑ ማርከሮችን ያነቃቃል (Konradi et al., 2014) እንዲሁም እንደ Rho GTPases እና matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang) ባሉ የሳይቶስኬል እድሳት ውስጥ የተሳተፉ ጂኖችን ይቆጣጠራል። እና ሌሎች፣ 2014)። 2022)፣ በተጨማሪም፣ እንደ ትራንስፎርሜሽን የእድገት ፋክተር-β (TGF-β)፣ የWnt ምልክት ማድረጊያ፣ ወዘተ ያሉ የተለያዩ የምልክት መንገዶችን ይነካል፣ በዚህም በTNBC ውስጥ የቲዩመር ወረራ እና ሜታስታሲስን ያበረታታል (ቼን እና ሌሎች፣ 2016)።) በርካታ ጥናቶች እና ሳይንሳዊ ማስረጃዎች እንደሚያሳዩት ZEB1 የTNBCን ለይቶ ለማወቅ እና የሕክምና ጣልቃ ገብነትን ለማድረግ እንደ ጠቃሚ ወኪል ትልቅ አቅም አለው። በቅርቡ በተደረገ ጥናት፣ ዋሪያ እና ሌሎች የTNBC ሞዴልን ተጠቅመው በdCas9 የZEB1ን ሙሉ በሙሉ መጨቆን አስመዝግበዋል። ስለዚህ፣ በጣም ከፍተኛ የሆነ ልዩነት እና በin vivo ሁኔታዎች ውስጥ የZEB1ን ሙሉ በሙሉ መከልከልን አስተውለዋል (Waryah et al., 2023)።
CRISPR/Cas12 CRISPR/Cpf1 የተባለ የጂን አርትዖት መሳሪያ ነው። ከCRISPR/Cas ስርዓት የተገኘ ሲሆን፣ Cas12 የሚለው ቃል ከCRISPR ጋር የተያያዘ ፕሮቲን 12ን የሚያመለክት ሲሆን (Bharathkumar et al., 2022) ከCas9 ጋር ሙሉ በሙሉ ተመሳሳይ ነው። ብቸኛው ልዩነት የCas12 ፕሮቲን መያዙ ነው። ከCas9 ጋር ሲነጻጸር፣ Cas12 በጂን አርትዖት ሂደት ውስጥ ተለጣፊ ጫፎችን መፍጠርን የመሳሰሉ ልዩ ተግባራት አሉት፣ Cas9 ደግሞ ጥርት ያሉ ጫፎችን ያመነጫል (Wang et al., 2021)። ይህ የCas12 ባህሪ ለተለየው የዲኤንኤ ማኔጅመንት ቴክኖሎጂ አስተዋጽኦ ያደርጋል። ኢላማውን ዲኤንኤ በትክክል ለይቶ ማወቅ እና መቁረጥ የሚችል ፕሮቲን እንደመሆኑ መጠን እጅግ በጣም ተለዋዋጭነት ያለው ሲሆን ይህም የጂን አርትዖትን ጨምሮ ለተለያዩ አፕሊኬሽኖች ውጤታማ መሳሪያ ያደርገዋል (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019)።
ልክ እንደሌሎች የCRISPR ልዩነቶች፣ CRISPR/Cas12 በTNBC ውስጥ ጂኖችን ማጥፋት ወይም ማነቃቃት ይችላል፣ በዚህም ምክንያት በበሽታ አምጪ ተህዋሲያን ወይም ለህክምና ምላሽ ጠቃሚ ሚና የሚጫወቱ ጂኖችን ኢላማ ያደርጋል (ያንግ እና ዣንግ፣ 2023)። ይህንን ሂደት ለማሳካት፣ Cas12ን ወደ ኢላማው ጂን የሚመራ መመሪያ አር ኤን ኤ (gRNA) ተዘጋጅቷል። Cas12 ከዒላማው ጋር ከተጣመረ በኋላ፣ በዲኤንኤ ውስጥ ድርብ-ክር መቆራረጥን ያስተዋውቃል እና የዲኤንኤ ጥገና ዘዴዎችን ያነቃቃል። በጥገና ሂደቱ ወቅት፣ ትክክል ያልሆኑ ኑክሊዮታይዶች ሊካተቱ ይችላሉ፣ ይህም ወደ ጂን ሚውቴሽን እና የተግባር መጥፋት ያስከትላል (Zhang et al., 2021a)። በተጨማሪም፣ የተሻሻለው የCas12 ኢንዛይም (dCas12 ተብሎ የሚጠራው) ስሪት ጂኖችን ለማግበርም ጥቅም ላይ ውሏል። ከትራንስክሪፕሽን አክቲቪተር ጋር በማጣመር፣ የተወሰኑ ጂኖችን ማነሳሳት እና በዚህም እነሱን ማግበር ይቻላል። ይህ ቴክኖሎጂ የቲዩመር አራሚ ጂኖችን ማግበርን በማስፋፋት ረገድ ትልቅ አቅም አለው (Sultan et al., 2022)።
ፕራይም አርትዖት አዲስ የዳበረ እና እጅግ የላቀ የጂኖም አርትዖት ቴክኖሎጂ ነው። የአንድን ኦርጋኒክ ዲኤንኤ በትክክል ማስተካከል ይችላል (ቼን እና ሊዩ፣ 2023)። ፕራይም አርትዖት የሚገኘው በሁለት ዋና ዋና ክፍሎች ውህደት ነው፡ የተሻሻለ CRISPR/Cas9 ኢንዛይም እና የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕቴዝ። የCRISPR/Cas9 ኢንዛይም ሚና በጂኖም ውስጥ ትክክለኛ ቦታዎችን በምርጫ ኢላማ ማድረግ ሲሆን፣ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕቴዝ ደግሞ ዲኤንኤውን በዒላማው ቦታ ላይ በደንብ ለመቀየር ይረዳል (ሃሰን እና ሌሎች፣ 2021)። በፕራይመር አርትዖት ዘዴ ውስጥ፣ የመጀመሪያው እርምጃ የፕራይመር አርትዖት መመሪያ RNA (pegRNA) መፍጠርን ያካትታል (Standage-Beier እና ሌሎች፣ 2021)። በታለመው ዲኤንኤ ውስጥ ከሚፈለገው የአርትዖት ጣቢያ ጋር የሚዛመድ የዒላማ ቅደም ተከተል እና RNA አብነት ይዟል። ከዚያም ፔግአርኤንኤ ከፕራይመር አርትዖት ኑክሊሴዝ (PE2) ጋር ወደ ኢላማ ሴሎች ይዋሃዳል። PE2 የCas9 ኢንዛይም፣ የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕቴዝ እና የፕራይመር አርትዖት አስማሚ (ማርቲን-አሎንሶ እና ሌሎች፣ 2021) የያዘ የፉዥን ፕሮቲን ነው። በሴሉ ውስጥ፣ የፔግአርኤንኤ እና የPE2 ውስብስብ ነገሮች ሊያሻሽሉት የሚፈልጉትን የተወሰነ ዲኤንኤ ይፈልጋሉ። Cas9 ኢንዛይም ዲኤንኤን ይቆርጣል እና ነጠላ ክሮች ያሉት አብነት ይፈጥራል (ቾይ እና ሌሎች፣ 2022)። የተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕቴዝ ዲኤንኤን ለማርትዕ ለማዘጋጀት ይህንን አብነት ይጠቀማል። ዲኤንኤን ከመቅዳት ጋር፣ የአርኤንኤ አብነት ለማርትዕ መመሪያዎችም ተካትተዋል። በመጨረሻም፣ አዲስ የተፈጠረው የዲኤንኤ ክር በዲኤንኤ ውስጥ ያለውን ክፍተት ለመጠገን እንደ አብነት ጥቅም ላይ ይውላል፣ ይህም የተፈለገውን ማሻሻያ የያዘ የተለወጠ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ያስከትላል (ኦቾአ-ሳንቼዝ እና ሌሎች፣ 2021)። የፕራይመር አርትዖት ዘዴዎች በጂኖች ውስጥ ሰፊ ሚውቴሽን ሊያስከትሉ ይችላሉ። የነጥብ ሚውቴሽን፣ ማስገቢያዎች፣ ስረዛዎች እና የጂን ምትክዎችን እንኳን ኢላማ ሊያደርግ ይችላል (አንዛሎን እና ሌሎች፣ 2019፤ ቼን እና ሊዩ፣ 2023)። የፕራይም አርትዖት ከቀደሙት የጂኖም አርትዖት ቴክኖሎጂዎች ጋር በርካታ ጥቅሞችን ይሰጣል። እነዚህም ትክክለኛነትን መጨመር፣ ከዒላማ ውጪ የሆኑ ውጤቶችን መቀነስ እና ዲኤንኤን በድርብ-ክር መግቻዎች ላይ ሳይተማመኑ የማርትዕ ችሎታን ያካትታሉ (አንዛሎን እና ሌሎች፣ 2020)።
የCRISPR/Cas9 ቴክኖሎጂ በመጀመሪያ የተገነባው ባክቴሪያዎችን ከፕላዝሚድ ዝውውር እና ከፌጅ ኢንፌክሽን ለመከላከል ሲሆን በኋላም ለጂኖም አርትዖት ውጤታማ አር ኤን ኤ ላይ የተመሠረተ የዲኤንኤ ኢላማ መሳሪያ ሆኖ እንደገና ጥቅም ላይ ውሏል (ጂያንግ እና ዱድና፣ 2017)። በተጨማሪም፣ የCRISPR/Cas9 ስርዓት በቅደም ተከተል በ50% እና 87% በባክቴሪያ እና አርኬያል ጂኖሞች ውስጥ እንደሚገኝ ተዘግቧል (ኢሺኖ እና ሌሎች፣ 2018)። CRISPR/Cas9 ማንኛውንም ያልተለመደ የጄኔቲክ ቅደም ተከተል በቪቮ እና በብልቃጥ ሁነታዎች ለመሰረዝ፣ ለማስገባት እና ለማስተካከል የሚያስችል መሳሪያ ነው (ሳቢት እና ሌሎች፣ 2021)። ከዚህም በላይ፣ CRISPR/Cas9 ለዒላማ ጂኖች ባለው ልዩነት ምክንያት የመላመድ የበሽታ መከላከያ ስርዓት አካል እንደሆነ ታይቷል (ቼን እና ዣንግ፣ 2018)።
CRISPR/Cas9 Cas9 እና አንድ ነጠላ መመሪያ RNA (sgRNA) ያካትታል። Cas9 በርካታ የፕሮቲን ክፍሎችን ያቀፈ ኢንዶኑክሊየስ ነው። በተጨማሪም፣ Cas9 ልዩ የሆነ የመዋቅር እና የመዋቅር ባህሪያት አሉት (Pacesa et al., 2022) ምክንያቱም ሁለት ሎቦችን ያካትታል፡ እውቅና (REC) እና ኑክሊዝ (NUC)። የREC ሎብ በተጨማሪ በሦስት ክልሎች ይከፈላል፡ REC1፣ REC2 እና የብሪጅ ሄሊክስ (Cromwell et al., 2018)። NUC ሶስት ሎቦችን ያቀፈ ነው፣ እነሱም RuvC (RuvC I፣ RuvC II፣ RuvC III)፣ HNH እና የፕሮቶስፔሰር ተያያዥ ሞቲፍ (PAM) መስተጋብር ጎራ (ምስል 1) (Song et al., 2016)። sgRNA CRISPR RNA (crRNA) እና ትራንስኮዲንግ ትንንሽ RNA (tracer RNA) ን ጨምሮ (ምስል 1)። sgRNA የCas9 ፕሮቲንን ከኮንኔክሲንስ ጋር ያገናኛል እና አክቲቭ ኮምፕሌክስ በመባልም ይታወቃል (ሪችተር እና ሌሎች፣ 2012)። crRNA የዒላማ ዲኤንኤ ቅደም ተከተሎችን በመለየት ረገድ ወሳኝ ሚና የሚጫወት 18-20 ኑክሊዮታይድ መሰረታዊ ጥንድ ነው። በተጨማሪም፣ crRNA ከዒላማ ዲኤንኤ ጋር ይጣመራል፣ እና ትራክአርኤንኤ የCas9 ኑክሌዝ ኢላማውን ዲኤንኤ ለማሰር እንደ ስካፎልድ ሆኖ ያገለግላል (ማንግዋር እና ሌሎች፣ 2019)። በሌላ በኩል፣ የPAM ቅደም ተከተል 3 ኑክሊዮታይዶች አሉት፣ ይህም የኢፌክተር ኮምፕሌክስን ከዲኤንኤ ጋር ማያያዝን ያረጋግጣል፣ ይገልፃል እና ያስተካክላል። የCas9 ፕሮቲን ኮምፕሌክስ ንዑስ ክፍሎች RuvC እና HNH የካታሊቲክ እንቅስቃሴ አላቸው (ሪችተር እና ሌሎች፣ 2012፤ አስማው እና ዛውዲ፣ 2021)። የCas9 ንዑስ ክፍል የHNH ኒውክሊየስ ጎራ ከcrRNA ጋር የተያያዘውን የዲኤንኤ ክር ይቆርጣል። የሩቭሲ ኒውክሊየስ ጎራ ሌሎች የዲኤንኤ ክሮችን ይቆርጣል እና ድርብ-ክር መግቻዎችን (DSBs) ይፈጥራል፣ ከዚያ በኋላ ሁለት የተለያዩ የዲኤንኤ መግቻ ጥገና ዘዴዎች ይነቃቃሉ (ጂያንግ እና ዱድና፣ 2017) (ምስል 1)።
ምስል 1. የCRISPR/Cas9 አጠቃላይ እይታ (A)። የCRISPR/Cas9 ስርዓት ክፍሎች፡ (i)። Cas9 endonuclease የታለመውን የዲኤንኤ ቅደም ተከተል ለመቁረጥ ኃላፊነት አለበት፣ (ii) የcrRNA እና የtra-crRNA ቺሜራዎች ውህደት የሚመጣ አንድ ነጠላ መመሪያ (sg) አር ኤን ኤ። (ሁለት)። Cas9 እንደ Rec I፣ Rec II፣ NUC ሎብ (HNH እና Ruv C ንዑስ ክፍሎች ናቸው) እና የPAM መስተጋብር ጎራ (C) ያሉ በርካታ ክፍሎችን ከተዛማጅ ተግባራት ጋር ያካትታል። የCRISPR/Cas9 ፕሮቲን ውስብስብ የዲኤንኤ ቅደም ተከተሎችን ወደ ማሟያ ያልሆኑ እና ማሟያ ቅርጾች (D) ይከፍላል። CRISPR/Cas9 ጂኖምን በሦስት ደረጃዎች ያስተካክላል፡ ማወቅ፣ መቁረጥ እና መጠገን። የተነደፈው sg-RNA Cas9ን ይመራል እና የሚፈለገውን ቅደም ተከተል በማሟያ ክፍል crRNA በኩል ይገነዘባል። Cas9 በ5′-NGG-3′ ላይ ያለውን የPAM ቅደም ተከተል ያውቃል እና ዲ ኤን ኤውን ያቀልጣል፣ የዲኤንኤ-አር ኤን ኤ ድብልቅ ይፈጥራል እና መቆራረጥን ያነቃቃል። የCas9 HNH ጎራ ተጓዳኝ ክርን ይቆርጣል፣ እና የRuvC ጎራ ተጓዳኝ ያልሆነውን ክር ይቆርጣል። CRISPR/Cas9 dsDNAን በሁለት መንገዶች በመሰብሰብ ያስተካክላል፡- ያልተመሳሳይ ጫፍ መቀላቀል (NHEJ) እና ሆሞሎጂ-ዳይሬክትድ ጥገና (HDR)። NHEJ የውጭ ተመሳሳይ ዲ ኤን ኤ በሌለበት ጊዜ ድርብ-ክር ያለው ዲ ኤን ኤ በኢንዛይማቲክ ሂደት በኩል ይጠግናል፣ ይህም የዘፈቀደ የዲ ኤን ኤ ቅደም ተከተሎችን ማስገባት ወይም ማስወገድ የሚችል የስህተት ተጋላጭነት ያለው ዘዴ ነው። HDR በጣም ልዩ እና ተመሳሳይ የዲ ኤን ኤ አብነቶችን ይፈልጋል።
CRISPR/Cas9-መካከለኛ የጥገና መንገዶች ተመሳሳይ ያልሆኑ የመጨረሻ መቀላቀል (NHEJ) እና ሆሞሎጂ-ዳይሬክትድ ጥገና (HDR) ዘዴዎችን ያካትታሉ። NHEJ ስህተትን የሚያስከትል መንገድ ነው ምክንያቱም ማስገባት ወይም መሰረዝን ስለሚያካትት እና በጥገና ዘዴው ወቅት ምንም አይነት ንድፍ አያስፈልገውም። መደበኛ ፕሮቲኖችን ለማመንጨት የዘፈቀደ ኑክሊዮታይዶችን ይጠቀማል (አባሲ እና ሌሎች፣ 2021)። ይህ የጥገና ስርዓት እንደ KU ውስብስብ፣ የመስቀል-ማሟያ ፕሮቲን ውስብስብ አይነት 4 (XRCC-4)፣ የዲኤንኤ መጨረሻ ማቀነባበሪያ ኢንዛይም እና የፕሮቲን ኪናሴ ዲኤንኤ-ፒኬሲዎች ያሉ አራት ውስብስብ ነገሮችን ያቀፈ ነው (አባሲ እና ሌሎች፣ 2021)። የKU ውስብስብ ፕሮቲን ሁለት ንዑስ ክፍሎች ያሉት ሲሆን ኩ 70 እና ኩ 80 ሲሆን፣ የጥገና ዘዴው የሚጀምረው ሁለት ንዑስ ክፍሎች (ኩ 70 እና ኩ 80) ከዒላማው ዲኤንኤ ጥርት ያለ ወይም ጥርት ያለ ጫፎች ጋር በማያያዝ ነው (አባሲ እና ሌሎች፣ 2021)፣ ሌሎች ከNHEJ ጋር የተያያዙ ነገሮችን ወደ ጉዳት ቦታ ለመመልመል እንደ ስካፎልድ ሆኖ ያገለግላል (ያንግ እና ሌሎች፣ 2020)። XRCC-4 እና የዲኤንኤ ሊጋዝ በቅደም ተከተል 334 እና 911 አሚኖ አሲዶችን ያቀፈ ሲሆን የXRCC4-DNA ሊጋዝ IV ውስብስብ የዲኤንኤ ጫፎችን መገጣጠም ያነቃቃል (ቻተርጂ እና ሌሎች፣ 2015)። የዲኤንኤ መጨረሻ ማቀነባበሪያ ኢንዛይም፣ ፖሊኑክሊዮታይድ ኪናሴ 3′-ፎስፌት በመባልም የሚታወቀው፣ የዲኤንኤ መጨረሻ ማቀነባበሪያ ኢንዛይም ነው። በዲኤንኤ ውስጥ ያለውን የ3′P ቡድን ማስወገድ እና በዲኤስቢ ጥገና ወቅት የ5′OH ቡድንን ፎስፈረስ ማድረግ ይችላል። እንዲሁም የኤስኤስቢ የጥገና መንገድን በመጠቀም የነጠላ-ክር መቆራረጦችን (SSBs) መጠገንን ያካትታል (Chatterjee et al., 2015)። ፕሮቲን ኪናሴ ዲኤንኤ-ፒኬሲዎች የዲኤንኤ ጥገኛ የፕሮቲን ኪናሴ ሲሆን የPIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) እና የአታክሲያ ቴላንጂኤክታሲያ ሚውቴትድ (ATM) ቤተሰብ ካታሊቲክ ንዑስ ክፍልን እንዲሁም የኤቲኤም እና የRad3-related ATRs. የክር መቆራረጦች (DSBs) እና የነጠላ-ክር መቆራረጦችን ያካትታል (Yue et al., 2020፤ ፔንግ እና ሌሎችም፣ 2016)።
ኤችዲአር የበለጠ ትክክለኛ እና ተስማሚ የጥገና ዘዴ ነው ምክንያቱም መረጃው የሚገለበጠው ተመሳሳይነት ባለው የዲኤንኤ ዱፕሌክስ ያልተነካ ቅርጽ በመጠቀም ነው፣ ምንም እንኳን የእህት ክሮማቲዶች መኖርን ቢጠይቅም። ይህ የሚከሰተው በአጥቢ እንስሳት ሴል ዑደት S/G2 ደረጃ ላይ ነው። ኤችዲአር በዋናነት በእርሾ ዝርያዎች ውስጥ ይከሰታል፣ ነገር ግን NHEJ በአጥቢ እንስሳት ላይ ወሳኝ ነው (በርማ እና ሌሎች፣ 2006፤ አባሲ እና ሌሎች፣ 2021)። የተሟላ የጥገና ዘዴ በስእል 1 ላይ ይታያል።
TNBC በጄኔቲክ እና በኤፒጄኔቲክ እክሎች ምክንያት ስለሚከሰት፣ CRISPR/Cas9ን በመጠቀም አደገኛ የጂኖሚክ/ኤፒጂኖሚክ እክሎችን ማስተካከል ምክንያታዊ የሕክምና አቀራረብ ሊሆን ይችላል (ቼን እና ሌሎች፣ 2019)። በተጨማሪም፣ በሴል-ተኮር የትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር ውስጥ የተሳተፉ አንዳንድ የትራንስክሪፕሽን ምክንያቶች የካንሰር ሴሎችን ልዩ ባህሪያት ሊያሳዩ ይችላሉ፣ ይህም የትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር ለካንሰር ሕክምና በጣም ጥሩ አቀራረብ ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማል (Drost et al., 2017)። እንደ ጄኔቲክ፣ ኤፒጄኔቲክ እና የትራንስክሪፕሽን እክሎች ያሉ የቲሞር ሞለኪውላዊ ባህሪያትን ለመድኃኒት ልማት መጠቀም ክሊኒካዊ ውጤቶችን ሊያሻሽል እና የማጣሪያ ወጪዎችን ሊቀንስ ይችላል። CRISPR ካንሰርን የሚያስከትሉ የጂኖሚክ ኢላማዎችን መለየት እና መለየት ብቻ ሳይሆን በሰው ሴሎች ውስጥ ኦንኮጂኖችን ለማረም፣ ለመጨቆን እና ኤፒጄኔቲክ በሆነ መንገድ ለማሻሻል ሊያገለግል የሚችል እምቅ የጂን አርትዖት መሳሪያ ነው (ሠንጠረዥ 1) (አህመድ እና ሌሎች፣ 2021)። ከቲሞር አጭበርባሪዎች፣ ኦንኮጂኖች እና የመድኃኒት መቋቋም ጋር የተያያዙ ጂኖችን ለመፈለግ በርካታ የCRISPR ምርመራዎች ተካሂደዋል። የተለያዩ የTNBC ኦንኮጂኖችን ለማረም የCRISPR/Cas9 አጠቃቀም በስእል 2 ላይ ይታያል።
ምስል 2. የተለያዩ የTNBC ኦንኮጂኖችን በCRISPR/Cas9 በመጠቀም የጂን ማስተካከያ የቲሞር እድገትን እና ሜታስታሲስን ይቀንሳል። እነዚህ ኦንኮጂኖች CDK7፣ NAT1፣ UBR5፣ YTHDF2፣ ITGA9፣ CXCR4 እና CXCR7፣ Crypto1፣ ROR1 እና ST8SIA ያካትታሉ፣ እነዚህም በTNBC መከሰት እና ሜታስታሲስ ውስጥ ይሳተፋሉ።
የካንሰር ሴል ፍልሰት፣ ወረራ እና የኤፒተልየል-ሜሴንቺማል ሽግግር (EMT) ከITGA9 ጋር የተያያዙ ናቸው። ቀደም ሲል የተደረጉ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ITGA9 በኖች መንገድ ውስጥ ቁልፍ ሚና የሚጫወት እና በራሃብዶዮሳርኮማ ሜታስታሲስ ውስጥ አስደሳች ሚና ይጫወታል (ሞሊስት እና ሌሎች፣ 2020)። በተጨማሪም፣ ITGA9 የጡት ካንሰርን ጨምሮ በበርካታ የቲዩመር ዓይነቶች ላይ ከታካሚ ትንበያ ጋር በቅርበት የተቆራኘ ሆኖ ተገኝቷል (Wang Z. እና ሌሎች፣ 2019)። በተጨማሪም፣ የITGA9 ባዮኢንፎርማቲክስ ትንተና እንደሚያሳየው በTNBC ውስጥ ያለው አገላለጽ ከሌሎች የጡት ካንሰር ንዑስ ዓይነቶች በእጅጉ ከፍ ያለ ነው። ከፍ ያሉ የITGA9 ደረጃዎች ከቲዩመር ሜታስታሲስ እና በTNBC ታካሚዎች ላይ እንደገና ከመከሰት ጋር የተቆራኙ ናቸው። በCRISPR/Cas9 የITGA9 መቋረጥ የካንሰር ስቴም ሴል (CSC) መሰል ባህሪያት፣ የቲዩመር አንጂዮጄኔሲስ፣ የቲዩመር እድገት እና በTNBC ውስጥ የβ-ካቴኒን መበላሸትን በማስፋፋት ሜታስታሲስን ቀንሷል (Wang Z. እና ሌሎች፣ 2019)።
ክሪፕቶ-1 የቲጂኤፍ-β ቤተሰብ አባል ሲሆን ለቅድመ ፅንስ መፈጠር፣ ለስቴም ሴል ጥገና እና ለካንሰር ሜታስታሲስ ወሳኝ ነው (ኢሺ እና ሌሎች፣ 2021)። እንዲሁም Tdgf-1 በመባል የሚታወቀው፣ የጥንታዊው ስትሪክ፣ ሜሶደርም እና ኢንዶደርም መፈጠርን በመቆጣጠር እንዲሁም በፅንስ መፈጠር ወቅት የሰውነት አካላት እድገት ውስጥ የግራ/ቀኝ አለመመጣጠን መመስረትን የሚያካትት ኦንኮጀኒክ ጂፒአይ-አንኮደር ምልክት ፕሮቲን ነው (ዣንግ እና ሌሎች፣ 2021b)። በተጨማሪም፣ ክሪፕቶ-1 እንደ ስቴም ሴል ምልክት ማድረጊያ በኤፒተልየል-ሜሴንቺማል ሽግግር (EMT) ውስጥ እንደሚሳተፍ ታይቷል (ዣንግ እና ሌሎች፣ 2021b)። EMT እንደ ፅንስ እድገት፣ ፋይብሮሲስ እና ቁስል ፈውስ ላሉ የተለያዩ ሂደቶች ብቻ ሳይሆን ለካንሰር ወረራ እና ሜታስታሲስም ወሳኝ ነው። በተጨማሪም፣ ክሪፕቶ-1 ከአራት የኖች ተቀባዮች ጋር መስተጋብር እንደሚፈጥር እና የድህረ-ትርጉም ብስለትን እንደሚያሻሽል ታይቷል (ብራንድስታድተር እና ማላርድ፣ 2019)። የኖች ምልክት ማድረጊያ መንገድ የሰውን የጡት ካንሰር ሴሎች በመጠበቅ ረገድ እንደሚሳተፍ ይታወቃል። ጥናቶች እንደሚያሳዩት CRISPR/Cas9-mediated የCrypto-1 knockout የካንሰር እድገትን እና ሜታስታሲስን ያግዳል። ስለዚህ፣ ክሪፕቶ-1 ለTNBC አስፈላጊ የሕክምና ኢላማ ሊሆን ይችላል (ካስትሮ እና ሌሎች፣ 2015)።
የXCL12 ፕሮቲን እና የኬሞኪኔ ተቀባይ CXC (CXCR4 እና CXCR7) በካንሰር ሴል መስፋፋት፣ እድገት፣ ፍልሰት እና ወረራ ውስጥ የተለያዩ ሚናዎችን ይጫወታሉ (Wu et al., 2015)። እነዚህ የኬሞሪሴፕተሮች በቪቮ እና በብልቃጥ ሞዴሎች ውስጥ በብዙ የምልክት መንገዶች በኩል ከTNBC እድገት ጋር ተያይዘዋል (Wu et al., 2015)። በተጨማሪም፣ የCXCR4 እና CXCR7 ማግበር ለሜታስታሲስ ከፍተኛ ተጋላጭነት እና በTNBC ውስጥ ደካማ ትንበያ ጋር የተቆራኘ ነው (Karn et al., 2022)። ስለዚህ፣ የCXCR4 እና CXCR7 ማንኳኳት TNBCን ጨምሮ ለጡት ካንሰር ሕክምና ውጤታማ የመድኃኒት ኢላማ ጂኖች ሊሆኑ ይችላሉ። በያንግ እና ሌሎች ያንግ እና ሌሎች (2019) የተደረገ ጥናት CRISPR/Cas9ን ተጠቅመው የTNBC መስፋፋት፣ እድገት፣ ፍልሰት እና ወረራ በከፍተኛ ሁኔታ እንደተከለከሉ አረጋግጧል (ያንግ እና ሌሎች፣ 2019)።
የቲኤንቢሲ ኦንኮጂን የሆነው የ miR-3662 መጠን መጨመር በጡት ካንሰር ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ታይቷል (Yi et al., 2022)። የ miR-3662 መቆራረጥ በ vivo እና in vitro ውስጥ የጡት ካንሰር ዕጢ እድገትን እና ሜታስታሲስን እንደሚገታ ታይቷል (Agarwal እና Gupta, 2021)። ኤችቢፒ-1 የ Wnt/-catenin ምልክት ማድረጊያ ኃይለኛ አጋች ሲሆን ለ miR-3662-መካከለኛ የ TNBC ሴሎች እድገት ተጠያቂ ሊሆን ይችላል። በቅርቡ፣ ዪ እና ሌሎችም የ miR-3662-HBP1 ዘንግ በ TNBC ሴሎች ውስጥ የ Wnt/-catenin ምልክት ማድረጊያ መንገድን እንደሚቆጣጠር ደርሰውበታል (Yi et al., 2022)። በቲሞር-ተኮር አገላለጹ ምክንያት፣ miR-3662 ለ TNBC የሕክምና ኢላማ ሊሆን ይችላል። ስለዚህ፣ CRISPR/Cas9-መካከለኛ የ miR-3662 መቆራረጥ ለ TNBC ሕክምና አዳዲስ መድኃኒቶችን ለማዘጋጀት በጣም ጥሩ አቀራረብ ሊሆን ይችላል።
UBR5 300 kDa ኑክሊዮፎስፎፕሮቲን ሲሆን በተለያዩ ካንሰሮች ውስጥ የቲዩመሪጄኔሲስ፣ የሜታስታሲስ እና የበሽታ መከላከያ ምላሽ ቁልፍ ተቆጣጣሪ ሆኖ ተለይቷል (ሼረር እና ሌሎች፣ 2015፤ ፉ እና ሌሎች፣ 2023)። UBR5 በTNBC ናሙናዎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የተሻሻለ እና በዩቢኪቲን ሊጋዝ እንቅስቃሴው አማካኝነት የERα ተግባርን የሚያነቃቃ መሆኑን ሪፖርት ተደርጓል (ቦልት እና ሌሎች፣ 2015)። በዋና ዋና የTNBC ናሙናዎች ላይ የተደረጉ አጠቃላይ የኤክሶም ቅደም ተከተል ጥናቶች የUBR5 መጨመርን አሳይተዋል፣ ይህም በTNBC እድገት ውስጥ ያለውን ሚና ያሳያል። በተጨማሪም፣ CRISPR/Cas9-በመንዳት የUBR5 መሰረዝ የTNBC ሜታስታሲስን በከፍተኛ ሁኔታ መከልከል እና በሙከራ መዳፊት ሞዴሎች ላይ እድገት አሳይቷል። ከዚህም በላይ፣ በዱር ዓይነት አይጥ ሞዴል ውስጥ የUBR5 ማካተት ሙሉ ተግባሩን ወደነበረበት መልሷል፣ ይህ ውጤት ግን በተነቃቁ የሚውቴሽን ዝርያዎች ላይ አልታየም (ሊያኦ እና ሌሎች፣ 2017)። የUBR5 እጥረት በTNBC ውስጥ በአፖፕቶሲስ፣ በኒክሮሲስ እና በደካማ የአንጎጄኔሲስ ምክንያት የቲሞር እድገትን ከመከልከል ጋር የተያያዘ ነው። በUBR5 መጥፋት ምክንያት የቲሞር ስርጭት ወደ ሩቅ የአካል ክፍሎች ይቀንሳል፣ እና UBR5 በዋናነት የኢ-ካድሄሪን አገላለጽን በመቀነስ ያልተለመደ EMTን ያስከትላል (ዣንግ እና ዌይንበርግ፣ 2018)። በቅርቡ፣ UBR5 በTNBC ውስጥ በ IFN-γ-በሚመጣው የPDL1 ግልባጭ ውስጥ በጣም አስፈላጊ ነገር እንደሆነ ታይቷል ምክንያቱም የE3 ubiquitination እንቅስቃሴ ባለመኖሩ። የRNA ግልባጭ ትንተና እንደሚያሳየው UBR5 ከ IFN-γ መንገድ ጋር በተያያዙ ጂኖች ላይ ስልታዊ ተፅእኖ ሊኖረው እና የፕሮቲን ኪናሴ አር ኤን ኤ (PKR) እና የምልክት ትራንስዱሰሮቹ እና አክቲቪተሮች የማግበር ደረጃዎችን በመጨመር የ PDL1 ግልባጭን ሊያበረታታ ይችላል። ግልባጭ 1 (STAT1) እና ኢንተርፌሮን ተቆጣጣሪ ፋክተር 1 (IRF1)። ይሁን እንጂ፣ በCRISPR/Cas9 የሚመራው የUBR5 እና የPD-L1 አገላለጽ ጥምረት መከልከል ብቻውን ከመከልከል ይልቅ ተመሳሳይ የሕክምና ውጤት አለው፣ ይህም በቲሞር ማይክሮ አካባቢ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራል (Wu et al., 2022)። ስለዚህ፣ CRISPR/Cas9 የUBR5 ተግባርን ለመግታት አስፈላጊ መሣሪያ ሊሆን ይችላል፣ በዚህም የTNBC ሜታስታሲስን እና የቲሞር እድገትን ይገታል።
ROR1 በካንሰር እና በፅንስ እድገት ወቅት የሚገለጽ አይነት I ትራንስሜምብራን ፕሮቲን ሲሆን እንደ ኦንኮፌታል ፕሮቲን ተለይቷል (ኒኮላስ ቦርቸርዲንግ፣ 2014)። የተለያዩ የሰው ልጅ ካንሰሮች ወራሪ ባህሪ ከ ROR1 መጨመር ጋር የተያያዘ ነው። ከ ROR1 ጋር ያነጣጠሩ የሕክምና ውህዶችን በሚያካትቱ ኢንቪቮ እና ኢንቪትሮ ጥናቶች ተስፋ ሰጪ ውጤቶች ተገኝተዋል (ቺየን እና ሌሎች፣ 2016)። በጡት ቲሹ ባዮፕሲዎች ውስጥ ከፍ ያለ የ ROR1 mRNA መጠን ከኃይለኛ ቤዛል መሰል የጡት (BL) ዕጢዎች እና ወደ ሌሎች የሰውነት ክፍሎች ከሚሰደዱት ጋር ተያይዟል። ከዚህም በላይ የ ROR1 ከመጠን በላይ መጋለጥ ለ TNBC እድገት እንደ ትንበያ ምልክት ተለይቷል (ቺየን እና ሌሎች፣ 2016)። ሆኖም፣ የ TNBC እድገትን እና ሜታስታሲስን ለመግታት CRISPR/Cas9ን በመጠቀም ROR1ን ዝም ማለት ውጤታማ ስትራቴጂ ይሆናል።
የሲያሊላይዜሽን ሂደቱ በሲያሊል ትራንስፈርሬዝስ (STs) የሚቀሰቀሰውን ሲሊሊክ አሲድ ወደ ግሉኮኮንጁጌትስ መጨመርን ያካትታል። ST8SIA1 የST ቤተሰብ ሲሆን እንደ ሊምፎሳይቲክ ሉኪሚያ እና ኮሎሬክታል ካንሰር ባሉ የተለያዩ በሽታዎች መንስኤነት ውስጥ ትልቅ ሚና ይጫወታል (ቻንግ እና ሌሎች፣ 2018)። የRNA ቅደም ተከተል ትንተና እንደሚያሳየው ST8SIA1 በTNBC ታካሚዎች የጡት ቲሹ ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ይገለጻል እና በቲሞር አፋኝ ጂን p53 ውስጥ ከሚውቴሽን ጋር በአዎንታዊ መልኩ የተቆራኘ ነው፣ ይህም ለTNBC በሽታ አምጪነት አስተዋጽኦ ሊያደርግ ይችላል (ባትቱላ እና ሌሎች፣ 2017)። በተጨማሪም፣ ST8SIA1 በTNBC ሜታስታሲስ እና እንደገና መከሰት ውስጥ ይሳተፋል፣ ይህም በTNBC መከሰት እና እድገት ውስጥ ትልቅ ሚና እንደሚጫወት ይጠቁማል። በTNBC ኢንቪትሮ ሞዴል፣ በCRIPSR/Cas9 የST8SIA1 መምታት እድገትን እና ሜታስታሲስን እንደሚያግድ ታይቷል (ባትቱላ እና ሌሎች፣ 2017)። ይህ የሚያሳየው CRISPR/Cas9 የST8SIA1 ኦንኮጂንን ተግባር በTNBC ሕክምና ውስጥ ለመግታት ጠቃሚ መሣሪያ ሊሆን እንደሚችል ነው።
NAT1 የደረጃ II xenobiotic ውህዶችን መፈጠር የሚያነቃቃ እና በሁሉም የሰው ልጅ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ማለት ይቻላል የሚገለጽ የሜታቦሊክ ኢንዛይም ነው። NAT1 አሮማቲክ አሚን ንጣፍ በሌለበት ጊዜም ቢሆን አሲቲል-ኮአ (አሲቲል-ኮአ) ኢላማ ለማድረግ ኮፋክተር ፎሌትን ሊጠቀም ይችላል (ስቴፕ እና ሌሎች፣ 2015፤ ላውሪሪ እና ሌሎች፣ 2014)። ጥናቶች እንደሚያሳዩት NAT1 በጡት ካንሰር ሴል ሞዴሎች ውስጥ የማትሪክስ ሜታሎፕሮቲኔዝ 9 (MMP9) ተግባርን ይቆጣጠራል እና በግሉኮስ ረሃብ ወቅት ከሚከሰቱት ምላሽ ሰጪ የኦክስጅን ዝርያዎች (ROS) ይከላከላል (Wang እና ሌሎች፣ 2018)። የNAT1 መሰረዝ የፒሩቫት ዴሃይድሮጅኔዝ ውስብስብን እንደሚገታ ታይቷል፣ ይህም ወደ ሚቶኮንድሪያል ችግር ያስከትላል (Wang L. እና ሌሎች፣ 2019)። በተጨማሪም፣ ሌሎች በርካታ ሪፖርቶች ትናንሽ ሞለኪውሎችን እና የ siRNA ዝምታን መጠቀም የ NAT1 መከልከል የጡት ካንሰር ሴሎችን ወረራ እና መስፋፋት ሊቀንስ እንደሚችል አሳይተዋል (ስቴፕ እና ሌሎች፣ 2018)። በቅርቡ፣ CRISPR/Cas9 በጡት ካንሰር ሴል መስመር MDA-MB-231 ውስጥ NAT1ን ለመግታት ጥቅም ላይ ውሏል፣ ይህም በሴሉላር ሜታቦሊዝም ላይ ተጽዕኖ ያሳድራል፣ ይህም በአገላለጽ ደረጃው ላይ በመመስረት። ይህ ጥናት NAT-1 ለTNBC እድገት እና ሜታስታሲስ ወሳኝ መሆኑንም አሳይቷል (ካርሊስል እና ሌሎች፣ 2020)።
የኦንኮጂኖች የተቀናጁ ቅጂዎች የሚቆጣጠሩት በሱፐር ኢንተለጀንሰሮች፣ በትራንስክሪፕሽን ፋክተሮች እና በኮፋክተሮች ነው (Hnisz et al., 2015)። በተጨማሪም፣ እንደ CDK7፣ CDK8፣ CDK9፣ CDK12 እና CDK13 ያሉ ሳይክሊን-ጥገኛ ኪናሴዎች (CDKs) ቡድን ለትራንስክሪፕሽን ቁጥጥር ያስፈልጋሉ። ከእነዚህም መካከል CDK7 በ TNBC በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ውስጥ የኦንኮጂን ቅጂ ለመጀመር እና ለማስፋፋት በጣም አስፈላጊ የሆነውን የ RNA ፖሊሜሬዝ II ፎስፈረስላይዜሽን ውስጥ ይሳተፋል። በአንድ ወሳኝ ጥናት፣ በ CRISPR/Cas9 CDK7 መሰረዝ TNBCን አግዷል፣ ይህም የ TNBC በሽታ አምጪ ተህዋሲያን CDK7 ጥገኛ መሆኑን ያሳያል (Wang Y. et al., 2015)።
ጥናቶች እንደሚያሳዩት በMYC እና RBP (RNA ማያያዣ ፕሮቲን) ውስጥ የሚደረጉ ሚውቴሽኖች ወደ አፖፕቶሲስ ሊያመሩ ይችላሉ፣ በMYC ወይም RBP ውስጥ ያሉ ነጠላ የጂን ሚውቴሽኖች የካንሰር ሴሎችን እድገት ላይ ተጽዕኖ አያሳርፉም (ኢንስታይን እና ሌሎች፣ 2021)። በሰው ጂኖም ውስጥ ከ1000 በላይ RBPs በCRISPR/Cas9 ላይ የተመሠረተ ቤተ-መጽሐፍትን በመጠቀም ተፈትሸዋል። ከእነዚህም መካከል 57 RBPs በከፍተኛ ደረጃ የMYC መጠን ላላቸው የካንሰር ሴሎች እድገት ወሳኝ እንደሆኑ ተረጋግጧል (ዊለር እና ሌሎች፣ 2020)። በተጨማሪም፣ YTHDF2 የTNBC ሴል እድገትን ለመጠበቅ አስፈላጊ ሲሆን ከፍተኛ የMYC አገላለጽ ባላቸው የካንሰር ሴሎች ውስጥ በከፍተኛ ደረጃ ግልባጭ እና ትርጉም ወቅት የሜቲላይትድ ግልባጭ መጠንን ይቀንሳል። በተጨማሪም፣ YTHDF2 ለካንሰር ሴሎች አስፈላጊ አይደለም፣ እነዚህም የTNBC ታካሚዎችን ህልውና ለማራዘም ከፍ ባሉ የMYC ደረጃዎች ላይ ብዙም ጥገኛ አይደሉም (ኢንስታይን እና ሌሎች፣ 2021)፣ ይህም TNBCን ሊያሸንፉ ለሚችሉ መድኃኒቶች የሕክምና ኢላማ ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማል።
የዚንክ ጣት ፕሮቲኖች (ZNFs) ከጠቅላላው የሰው ልጅ ጂኖም 1% ያህሉን ይይዛሉ። ጥናቶች እንደሚያሳዩት ZNF እንደ የጉበት ካንሰር፣ የጡት ካንሰር እና የኮሎሬክታል ካንሰር ባሉ የተለያዩ ካንሰሮች ውስጥ የሴል እድገትን መቆጣጠር እንደሚችል አሳይተዋል (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017)። በCRISPR knockout የተፈጠሩ ቤተ-መጻሕፍት በጡት ካንሰር ሴሎች ውስጥ የተለያዩ የቲሞር አፋኝ ጂኖችን (TSGs) ለመመርመር ጥቅም ላይ ውለዋል (Shalem et al., 2014)። ከዚያን ጊዜ ጀምሮ፣ በCRISPR/Cas9 ZNF319 የተሰረዙ የጡት ካንሰር ሴሎች ላይ የተደረገ የትራንስክሪፕቶሚክ ጥናት እንደሚያሳየው ZNF319 የጡት ካንሰር መስፋፋትን የሚቀንስ እና በዚህም ምክንያት በተለያዩ የምልክት ዘዴዎች እና ሌሎች ባዮሎጂካል ተግባራት ውስጥ የሚሳተፍ የቲሞር አፋኝ ጂን መሆኑን አሳይቷል (Wang L. et al., 2022)።
ፌሮፕቶሲስ በብረት መኖር ላይ የተመሰረተ የፕሮግራም የተደረገ የሴል ሞት አይነት ነው። የፌሮፕቶሲስ እድገት በሊፒድ ፐርኦክሳይድ መኖር ተጽዕኖ እንደሚያሳድር ይታወቃል። በተጨማሪም፣ PKCβII ቀደምት የሊፒድ ፐርኦክሳይድ እንደሚያሳይ ተዘግቧል፣ እና የሊፒድ ፐርኦክሳይድ መጨመር ከፌሮፕቶሲስ ጋር የተቆራኘ ነው። የCRISPR/Cas9-mediated kinase inhibitors ቤተ-መጽሐፍትን በማጣራት PKCβII በሊፒድ ፐርኦክሳይድ ሂደት ውስጥ እንደሚሳተፍ አረጋግጧል፣ ይህም በMDA-MB-231 ሴሎች ውስጥ ለፌሮፕቶሲስ ወሳኝ ነው (Zhang et al., 2022)። ስለዚህ፣ ይህ የሚያሳየው PKCβII በCRISPR/Cas9 መምታት ከፌሮፕቶሲስ ጋር ለተያያዙ በሽታዎች ሕክምና ሊሆን የሚችል የቲዩመር ማፈን ጂን ኢላማ ሊሆን ይችላል (Zhang et al., 2022)።
የመድኃኒት መቋቋም በካንሰር በሽተኞች ላይ ለሚደርሰው ሞት ወደ 90% የሚጠጋውን ተጠያቂ እንደሆነ ይታመናል፣ እና በካንሰር ህክምና ውስጥ ካሉት ዋና ዋና ተግዳሮቶች አንዱ ነው (ቡኮቭስኪ እና ሌሎች፣ 2020)። ውጤቶቹ እንደሚያሳዩት ከመድኃኒት ፍሰት፣ ከዲኤንኤ ጥገና፣ ከአፖፕቶሲስ እና ከተለያዩ የሴል ምልክት መንገዶች ጋር የተያያዙ በቂ ቁጥር ያላቸው ጂኖች ከመድኃኒት መቋቋም ጋር የተቆራኙ ናቸው (ሃይደር እና ሌሎች፣ 2020)። ከእነዚህም መካከል በርካታ ጂኖች በCRISPR/Cas9 መሳሪያዎች ኢላማ የተደረጉ ሲሆን የመድኃኒት መቋቋምን በመቀነስ እና የፀረ-ካንሰር ሕክምናዎችን ውጤታማነት በመጨመር ረገድ ተስፋ ሰጪ ውጤቶችን አሳይተዋል (ቫጋሪ-ታባሪ እና ሌሎች፣ 2022)። በተጨማሪም፣ ከፍተኛ-ፍጥነት ያላቸው የCRISPR/Cas9 የጂን knockout ማጣሪያ ቤተ-መጻሕፍት ሊሆኑ የሚችሉ የመድኃኒት መቋቋም ጂን ኢላማዎችን ተግባር በመቀየር ላይ ተሳትፈዋል (ሻለም እና ሌሎች፣ 2015)። የፓክሊታክስል የመቋቋም ጂኖችን ለመለየት፣ የRNA ቅደም ተከተል ከጂኖም-አቀፍ የsgRNA ቤተ-መጽሐፍት ምርመራ ጋር ተዳምሮ ስምንት እጩ ጂኖችን ለመለየት ጥቅም ላይ ውሏል፣ እነዚህም ሂስቶን ዴአሲቲላዝ 9 (HDAC9)ን ጨምሮ፣ ተደጋጋሚ TNBC ባላቸው ታካሚዎች ላይ ከመድኃኒት መቋቋም ጋር የተያያዙ ናቸው (B et al., 2020)።)። በሌላ ጥናት፣ በፀረ-ካንሰር መድኃኒቶች የታከሙ የTNBC ታካሚዎች በሕይወት ሲተርፉ የዲሴሪን/ትሬዮኒን እና የታይሮሲን ፕሮቲን ኪናሴ (DSTYK) መጨመር ታይቷል። ከዚህም በላይ፣ በCRISPR/Cas9 የሚመራው የDSTYK መበላሸት በብልቃጥ ውስጥ የመድኃኒት መቋቋም የሚችሉ የካንሰር ሴሎችን አፖፕቶሲስ (SUM102PT ሴሎች እና MDA-MB-468 ሴሎች) እና በቪቮ TNBC ሞዴል (Ogbu et al., 2021) በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል።
ምንም እንኳን TNBC የMAPK መንገድ ያልተለመደ ማግበር ቢኖረውም፣ የMEK-ዒላማ ሕክምናዎች ክሊኒካዊ ተጽእኖ ደካማ ነው። የCRISPR/Cas9 የጂኖሚክ ቤተ-መጽሐፍት ስክሪን እንደሚያሳየው የPSMG2 (ፕሮቲኦም አሴምብል ቻፔሮን 2) መከልከል TNBC BT549 እና MB468 ሴሎችን ወደ MEK አጋቾች AZD6244 እንዲነቃነቅ ያደርጋል። የPSMG2 CRISPR/Cas9 መገደብ መደበኛ የፕሮቲኦዞም ተግባርን ቀይሮ የPDPK1 በራስ-ሰር እንዲፈርስ አድርጓል፣ በዚህም በAZD6244 (MEK አጋቾች) እና MG132 (ፕሮቲኦዞም አጋቾች) በሚመነጩ የTNBC አይጥ ሞዴሎች ውስጥ የቲዩመር ሴሎችን የበለጠ ያሻሽላል። ስለዚህ፣ ፕሮቲኦዞም እና MAP kinase (MEK) አጋቾች የቲዩመር ሴል መስፋፋትን ለመቀነስ በተመሳሳይ ጊዜ ሊሰጡ ይችላሉ (Wang X. et al., 2022)።
CRISPR/Cas9 እንዲሁም የቲኤንቢሲ መቋቋምን የሚያመጣውን የጂን ተግባር ማጣት ለማጣራት ጥቅም ላይ ውሏል (ሹ እና ሌሎች፣ 2020)። ጌ እና ሌሎችም በቲኤንቢሲ ውስጥ በቢቲ ብሮሞዶሜን አጋቾች (BBDI) JQ1 የታከሙ የካንሰር ሴሎች የመድኃኒት መቋቋም ዘዴን አብራርተዋል። CRISPR/Cas9ን በመጠቀም፣ የrb1 ጂን መሰረዝ TNBC ለፀረ-ካንሰር መድሃኒት JQ1 መቋቋም እንዲችል እንዳደረገው ደርሰውበታል። ስለዚህ፣ በTNBC ውስጥ ለJQ1 መድሃኒቶች ምላሽ ለመስጠት የrb1 ተግባር አስፈላጊ ነው። እንዲሁም ፓክሊታክስል CDK4/6 kinase/microtubule inhibitor መሆኑን እና እንደ JQ1 ካሉ BBDIዎች ጋር ያለው ጥምረት ለመድኃኒት መቋቋም ለሚችሉ TNBC ተስፋ ሰጪ የሕክምና ምላሾችን ሊሰጥ እንደሚችል ዘግበዋል (Ge እና ሌሎች፣ 2020)።
የረጅም ጊዜ ኮድ-አልባ አር ኤን ኤ (lncRNA) የትራንስክሪፕሽን ገጽታ በTNBC ውስጥ ለኒዮአድጁቫንት ሕክምና መቋቋም ተጠያቂ እንደሆነ ተዘግቧል። ይህ ጥናት እንደሚያሳየው አምስት የተለያዩ የMALAT1 lncRNA ግልባጮች በTNBC ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ይገለጻሉ። በተጨማሪም፣ CRISPR/Cas9-mediated የMALAT1 መሰረዝ የTNBC BT-549 ሴሎች ለፓክሊታክስል እና ለዶክሶሩቢሲን ስሜታዊነት እንዲጨምር አድርጓል፣ ይህም በTNBC ውስጥ ለMALAT1 መቋቋም ሊኖር የሚችል ሚና ይጠቁማል (ሻዝ እና ሌሎች፣ 2021)።
በBRCA1 (BRCA1m) ውስጥ የሚደረጉ ሚውቴሽኖች የተለያዩ በመሆናቸው ለመለየት አስቸጋሪ ናቸው። የBRCA1 ሰው ሰራሽ ገዳይ አጋር የሆነውን PARP1 (ፖሊ(ADP-ribose) ፖሊሜሬዝ) ኢላማ ማድረግ የTNBC መድሃኒት ኬሞሴንሲቲቭነትን ሊጨምር ይችላል። CRISPR/Cas9ን በመጠቀም፣ የPARP1 መሰረዝ እንደ ዶክሶሩቢሲን፣ ጌምሲታቢን እና ዶሴታክስል ያሉ ፀረ-ካንሰር መድኃኒቶች ለ mBRCA1 ሚውቴሽን TNBC ሴሎች ስሜታዊነትን ጨምሯል፣ ይህም PARP1 በTNBC ውስጥ በመድኃኒት መቋቋም ውስጥም እንደሚሳተፍ ይጠቁማል (ቫጋሪ-ታባሪ እና ሌሎች፣ 2022)። በቲሞር አፋኝ ጂኖች ውስጥ የሚደረጉ ሚውቴሽኖች BRCA1 ወይም BRCA2 በሰዎች ላይ የጡት ካንሰር የመያዝ እድልን እንደሚጨምሩ ይታወቃል። የእነዚህ ታካሚዎች ሕክምና የPARP አጋቾችን መጠቀም ይጠይቃል። በተጨማሪም፣ የኒኩሊዮታይድ ሳልቬጅ ፋክተር DNPH1ን CRISPR/Cas9 በመጠቀም ማንኳኳት መርዛማውን ኑክሊዮታይድ 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) ሞኖፎስፌት ማስወገድ እንደሚችል ተረጋግጧል፣ በዚህም የBRCA እጥረት ያለባቸው ሴሎች ለPARP አጋቾች ስሜታዊነት ምላሽ እንዲሰጡ ያደርጋል (Fugger)። እና ሌሎችም፣ 2021። ስለዚህ፣ CRISPR/Cas9 እና PARP1 አጋቾች ለTNBC አስፈላጊ የሕክምና ስትራቴጂ ሊሆኑ ይችላሉ።
የፔኔትራንት ግላይኮፕሮቲን (P-gp) ጂን በአጠቃላይ ከጠቅላላው TNBC በግምት 41% ውስጥ የተሻሻለ ባለብዙ መድሃኒት የመቋቋም ጂን ነው (ሰን እና ሌሎች፣ 2020)። በP-gp የሚመጣ የመድኃኒት ፍሰት በጡት ካንሰር ውስጥ የመድኃኒት የመቋቋም ቁልፍ ተቆጣጣሪ ሆኖ ተለይቷል። በP-gp አጋቾች በጡት ካንሰር ውስጥ ለፀረ-ካንሰር መድኃኒቶች ስሜታዊነት መጨመር አሳይተዋል (Famta et al., 2021)። ስለዚህ፣ CRISPR/Cas9-mediated ablation ወይም የP-gp እና P-gp አጋቾች መጨቆን በTNBC ውስጥ የመድኃኒት መቋቋምን ለማሸነፍ በጣም አስፈላጊ ዘዴዎች ሊሆኑ ይችላሉ።
የATP-binding cassette transporter G2 (ABCG2) በTNBC ውስጥ የመድኃኒት መቋቋምን እንደሚያስከትል ይታወቃል (ፓላሱበርኒያም እና ሌሎች፣ 2015)፣ ምንም እንኳን በአሁኑ ጊዜ በCRISPR/Cas9 እና በABCG2 ዝምታ እና በቲሞር አፋኝ ጂን መቆራረጥ መካከል ስላለው ግንኙነት ምንም ዘገባዎች ባይኖሩም። PTEN የABCG2 ማግበርን ሊያሻሽል ይችላል (ፓላሱበርኒያም እና ሌሎች፣ 2015)፣ (ዲፓክ ሲንግ እና ሌሎች፣ 2021)። ስለዚህ፣ CRISP/Ca9ን ABCG2 ለማስወገድ እና ከABCG2 አጋቾች ጋር ማጣመር በTNBC ውስጥ የመድኃኒት መቋቋምን ለማሸነፍ ተስማሚ ሕክምና ሊሆን ይችላል። ሠንጠረዥ 2 ሁሉንም የመቋቋም ጂኖች የሚያነጣጥረው CRISPR/Cas9ን ይጠቅሳል።
ሠንጠረዥ 2. CRISPR/Cas9 ሴሎችን ለፀረ-ካንሰር መድኃኒቶች ለማነቃቃት የተለያዩ የTNBC መቋቋም ጂኖችን ኢላማ ያደርጋል።
የCRISPR/Cas9 ቤተ-መጻሕፍት ከካንሰር በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ጋር የተያያዙ የጂን ሚውቴሽንዎችን ለማጣራት እምቅ መሳሪያዎች ናቸው (ቻን እና ሌሎች፣ 2022)። ይህ የማጣሪያ ዘዴ (ሀ) የቤተ-መጻሕፍት ግንባታ፣ (ለ) የሌኒቫይራል ትራንስዱክሽን፣ (ሐ) የፊኖታይፒክ ምርመራ እና (መ) የዒላማ ጂን ትንተና ያሉ አራት ደረጃዎችን ያካትታል። ምንም እንኳን TNBC የMAPK መንገድ ያልተለመደ ማግበር ቢኖረውም፣ እንደ PTEN፣ RB1 እና TP53 ባሉ የቲሞር ማፈን ጂኖች ውስጥ ሚውቴሽን ለሚይዙ የTNBC ታካሚዎች የMEK ኢላማ ሕክምና ክሊኒካዊ ትንበያ በጣም ደካማ ነው።
በተጨማሪም፣ CRISPR/Cas9ን በመጠቀም የተደረገ የጂን knockout screen በጓቲማላ የአበባ እና የቅጠል ተዋጽኦዎች ውስጥ በብዛት የሚገኘውን ዴሃይድሮካትሮል የተባለውን ሞክሯል። የተመረጠ የሴል ሳይቶቶክሲዝም ዘዴዎች። የTNBC ንዑስ ዓይነቶች ሜሴንቺማል ግንድ ባህሪያት። ይህ CRISPR/Cas9-based screen በተጨማሪም HSD17B11፣ 17β-hydroxysteroid dehydrogenase አይነት 11 የሚይዘው ጂን፣ በMDA-MB-231 ሴሎች ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ እንደሚገለጽ እና ለMDA-MB-231 ሴሎች የተወሰነ ዴሃይድሮፋልካሪኖል እንደሚያመጣ አሳይቷል (ግራንት እና ሌሎች፣ 2020)። ስለዚህ፣ ይህ የCRISPR/Cas9 ጂኖሚክ ምርመራ እምቅ የተፈጥሮ ውህዶች ፀረ-ካንሰር ባህሪያትን ለመለየት ትልቅ አቅም እንዳለው ያሳያል።
በተጨማሪም፣ የTNBC ለካንሰር ያለው ተጋላጭነት በቪቮ CRISPR/Cas9 ስክሪን ላይ ያልተዛባ ጂኖም-አቀፍ የCRISPR/Cas9 ስክሪን በመጠቀም ጥናት ተደርጎበታል፣ ይህም በኦንኮጂኒክ እና በቲሞር አፋኝ መንገዶች መካከል ያለውን ግንኙነት ያሳያል። የmTOR እና የሂፖ መንገዶች ቁልፍ ክፍሎች በTNBC ውስጥ በቲሞር ቁጥጥር ውስጥ አስፈላጊ ሚና እንደሚጫወቱ ተዘግቧል። በተጨማሪም፣ ጥናቶች እንደሚያሳዩት የmTORC1/2 እና የYAP ኦንኮፕሮቲን ፋርማኮሎጂካል መከልከል በቪትሮ ውስጥ የመድኃኒት-ማትሪክስ ሲነርጂ ሞዴል እና በቪቮ ውስጥ በታካሚ የተገኙ ዜኖግራፍትስን በመጠቀም የTNBC በሽታ አምጪነትን ውጤታማ በሆነ መንገድ ይከላከላል። ከዚህም በላይ፣ የቶሪን-1-መካከለኛ mTORC1/2 መከልከል ማክሮፒኖሳይቶሲስን ያሻሽላል፣ የቨርቴፖርፊን-የያፕ መከልከል ደግሞ የTNBC ሴል ሞትን ያስከትላል። እነዚህ ውጤቶች አንድ ላይ ሲጣመሩ፣ ለTNBC አዳዲስ እና ውጤታማ ህክምናዎችን ለመለየት በጂኖም-አቀፍ የCRISPR ምርመራ ኃይል እና ጥንካሬን ያጎላሉ (ዳይ እና ሌሎች፣ 2021)።
የበሽታ መከላከያ ስርዓትን አለማስተካከል በቲሞሪጀኔሲስ ውስጥ አስፈላጊ ነገር ነው። የካንሰር ሴሎች የመከላከያ ዘዴዎችን በማለፍ የበሽታ መከላከያ ዘዴዎችን በማለፍ ያመልጣሉ፣ ይህም በቲሞር ማይክሮ አካባቢ ውስጥ የበሽታ መከላከያ ሴሎች እንቅስቃሴን ጣልቃ በመግባት እና የበሽታ መከላከያ ስርዓቱን በማበላሸት ጭምር ነው። ስለዚህ የተሻሻለ የበሽታ መከላከያ ስርዓት መገንባት ዕጢዎችን ለመዋጋት ቁልፍ አቀራረብ ሊሆን ይችላል። የCRISPR/Cas9-based gene ማሻሻያ አጠቃቀም ከተለያዩ አመለካከቶች የበሽታ መከላከያ ችግር ጋር የተያያዙ በርካታ ጉዳዮችን ይፈታል። CRISPR/Cas9 በሚከተሉት መንገዶች ከጡት ካንሰር ጋር ፀረ-ቲሞር መከላከያን ለማሻሻል ጥቅም ላይ ውሏል (ምስል 3)።
ምስል 3. CRISPR/Cas9 የበሽታ መከላከያ ህክምና የTNBC ሴሎችን ኢላማ ያደርጋል። የCDK5 መጥፋት እና የPDL1 እና CD155 መበላሸት የበሽታ መከላከያ ስርዓትን ያሻሽላሉ። በተመሳሳይ፣ የA2AR መጥፋት እና እንደ HER2፣ mucin 1 እና TEM8 ያሉ TAAዎችን ማበላሸት የካንሰር ሴሎችን በመግደል የCAR-T ሴሎችን ውጤታማነት ጨምሯል። CRISPR/Cas9-የሚመራ የT ሴል ምርመራ እንደሚያሳየው የp38 kinase መስተጓጎል የT ሴል ፀረ-ቲሞር እንቅስቃሴን ያሻሽላል። በCRISPR/Cas9 የተሻሻሉ የT ሴሎች የTCR (T ሴል ተቀባይ) አገላለጽን ይጨምራሉ፣ ይህም የT ሴሎች ፀረ-ቲሞር እንቅስቃሴ እንዲኖራቸው ያደርጋል።
የኢሚውኖቴራፒ ዓላማ የበሽታ መከላከያ ስርዓቱ የካንሰር ሴሎችን እንዲያጠቃ ማነቃቃት ነው። የበሽታ መከላከያ መቆጣጠሪያ ፕሮቲኖች ከመጠን በላይ መጋለጥ ብዙውን ጊዜ ራስን የመከላከል ምላሾችን ይከላከላል ነገር ግን ካንሰሮች እነሱን ለማስወገድ ሊረዳቸው ይችላል (ቶፓሊያን እና ሌሎች፣ 2015)። እነዚህ ፕሮቲኖች የበሽታ መከላከያ ምላሾችን በበሽታ መከላከያ ሴሎች ወለል ላይ ካሉ ተቀባዮች ጋር በማያያዝ ይከላከላሉ። በርካታ የፍተሻ ፕሮቲኖች (እንደ CD155 እና PD-L1 ያሉ) የPD-1 ተቀባይን በኢሚውኖ ሴሎች ላይ ያነጣጠሩ ሲሆን በጡት ካንሰር በተለይም TNBC ውስጥ ይገለፃሉ (Li Y.-C. እና ሌሎች፣ 2020)። የPD-L1 ወይም ተቀባዩን በCRISPR/Cas9 በመጠቀም መገደብ የበሽታ መከላከያ ስርዓቱ የTNBC ዕጢዎችን እንዲያጠቃ ሊያነቃቃ ይችላል (Yahata እና ሌሎች፣ 2019)። በተጨማሪም፣ በCRISPR/Cas9-mediated CDK5 መሰረዝ በኩል የPD-L1 አገላለጽ መቀነስ በብልቃጥ እና በቪቮ ውስጥ የቲሞር እድገትን እንደሚገታ ታይቷል (Deng እና ሌሎች፣ 2020)። የጡት ካንሰር እድገትን መገደብ በብልቃጥ እና በቪቮ ሞዴሎች ውስጥ የ shRNA-mediated CD155 ቅነሳ በጡት ካንሰር ላይ የሕክምና ውጤት ሊኖረው እንደሚችል ይጠቁማል (ጋኦ እና ሌሎች፣ 2018)።
የCAR ቲ ሴሎች ከዕጢ ጋር የተያያዙ አንቲጂኖችን (TAAs) የሚለዩ እና እንቅስቃሴያቸውን ለማሻሻል የፍተሻ ፕሮቲኖችን ማጥፋት የሚችሉ CARዎችን ይገልጻሉ (Li C. et al., 2020)። በጡት ካንሰር ውስጥ ለCAR ቲ ሴል ሕክምና የተለያዩ ሊሆኑ የሚችሉ ኢላማዎች አሉ፣ ከእነዚህም ውስጥ HER2፣ mucin1 እና TEM8 (Bajgain et al., 2018) ይገኙበታል። ሜሶቴሊንን የሚያነጣጥሩ (በTNBC BT-459 ሴሎች ውስጥ ከመጠን በላይ የተገለጹት) የCAR ቲ ሴሎች PD-1 በCRISPR/Cas9 ሲጠፋ ካንሰርን ለመከላከል የበለጠ ውጤታማ እንደሚሆኑ የሚያሳይ ማስረጃ አለ (Hu et al., 2019)። ሆኖም፣ የT ሴሎችን ከታካሚዎች መለየት እና ከዚያም ex vivo ማረም የሰው ጉልበት የሚጠይቅ እና ጊዜ የሚወስድ ሂደት ነው። ምንም እንኳን ሁለንተናዊ የT ሴሎች የመገለል መስፈርቶችን ሊቀንሱ ቢችሉም፣ የሰው ሉኮሳይት አንቲጂን (HLA) ክፍል I እና የT ሴል ተቀባይ (TCR) የሚገልጹ የለጋሽ ቲ ሴሎች ከግራፍት-ቨርሰስ-አስተናጋጅ ያልተለመዱ ነገሮችን ለመከላከል መወገድ አለባቸው (Ren et al., 2017)። , 2017a)። CRISPR/Cas9ን በመጠቀም፣ HDR በተመሳሳይ ጊዜ TCR እና HLA ን ያስወግዳል እና CAR ን የሚቀየረውን ጂን ያጠፋል። ጥናቶች እንደሚያሳዩት CRISPR/Cas9 ፀረ-ሲዲ19 CARዎችን ወደ TCR ሎከስ ለማስተዋወቅ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል፣ በዚህም የቲ ሴሎችን ሳያሟጥጡ CARዎችን በብቃት ያመነጫሉ (ዲሚትሪ እና ሌሎች፣ 2022)። የመልቲፕሌክስ ቴክኖሎጂዎች TCR፣ ቤታ-2-ማይክሮግሎቡሊን (B2M)፣ HLA-I ንዑስ ክፍል እና እንደ PD-1 እና CTLA-4 ያሉ ሌሎች ፕሮቲኖችን በአንድ ጊዜ በማስወገድ አሎጅኒክ CAR T ሴሎችን ለማመንጨት ተዘጋጅተዋል፣ እነዚህም በTNBC ላይ የበለጠ የፀረ-ካንሰር ባህሪያት ሊኖራቸው ይችላል (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022)።
CRISPR/Cas9ን መጠቀም የCAR-T ሴሎችን ውጤታማነት ሊያሻሽል ይችላል። አዴኖሲን የበሽታ መከላከያ ባህሪያት እንዳሉት ይታወቃል እና የT ሴል ተግባርን በማገድ እና የአዴኖሲን A2A ተቀባዮችን (A2AR) በማግበር የፀረ-ካንሰር መከላከያን ሊቀንስ ይችላል (ቪጋኖ እና ሌሎችም፣ 2019)። CRISPR/Cas9ን በመጠቀም A2ARን ጸጥ ማድረግ በቪቮ ውስጥ የCAR-T ሴሎችን ውጤታማነት በእጅጉ አሻሽሏል (ጂዩፍሪዳ እና ሌሎችም፣ 2021)። የT ህዋሶች እንደ ሴሉላር መስፋፋት፣ ልዩነት፣ ኦክሲዴቲቭ ውጥረት እና የጂኖሚክ ውጥረት ያሉ የተለያዩ የፊኖታይፒክ ባህሪያትን እንደሚያሳዩ ይታወቃል። CRISPR/Cas9-based T ሴል ምርመራ 25 የተለያዩ የT ሴል ተቀባይ ኪናሴዎች መስተጓጎልን አሳይቷል። ከእነዚህም መካከል የp38 ኪናሴ መሰረዝ የT ህዋሶችን ፀረ-ቲሞር እንቅስቃሴ እንደሚያሻሽል ታይቷል፣ ይህም p38 ኪናሴ የCAR-T ሴል ቁጥጥር ቁልፍ ተቆጣጣሪ መሆኑን ያሳያል (ጉሩሳሚ እና ሌሎችም፣ 2020)።
የቲ ሴሎች በCRISPR/Cas9 በመጠቀም በጄኔቲክ ሊሻሻሉ እና ከፍተኛ መጠን ያላቸውን TCRs ለማምረት ይችላሉ። በጄኔቲክ የተሻሻሉ የቲ ሴሎችን ወደ ታካሚዎች ማስተላለፍ ከኢንዶጂን ቲ ሴሎች የበለጠ ጠንካራ የፀረ-ካንሰር እንቅስቃሴ አሳይቷል። ስለዚህ፣ ኢንዶጂን ቲሲአርዎች በታካሚዎች ላይ በጄኔቲክ ከተለወጡ TCRs ጋር ሊወዳደሩ ይችላሉ፣ ይህም የካንሰር ኢሚውኖቴራፒ አቅም ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። ይህንን ችግር ለማሸነፍ፣ በተቀባይ ሴሎች ውስጥ ኢንዶጂን ቲሲአር-βን ለማስወገድ CRISPR/Cas9ን መጠቀም እና በመቀጠልም TCR-β ቲ ሴሎችን ወደ ካንሰር ታካሚዎች ለማስተላለፍ ኢንዶጂን ቲሲአር-ቤቲን መጠቀም ኢንዶጂን ቲሲአር ወሲባዊ ውድድር ሳያስፈልግ የተሻሉ ፀረ-ካንሰር የበሽታ መከላከያ ምላሾችን ሊያሳይ ይችላል (Fan et al. 2018)። ስለዚህ፣ ከCRISPR የተሻሻሉ የቲ ሴሎች በስተቀር፣ TCRs ከመደበኛ TCR የተወሰዱ የቲ ሴሎች በሺህ እጥፍ ለቲሞር አንቲጂኖች የበለጠ ስሜታዊ ናቸው። በተጨማሪም፣ በተለያዩ ሉኪሚያዎች፣ በγδ TCR+ CRISPR የሚመነጩ የተለወጡ የቲ ሴሎች ከመደበኛ TCR ዝውውር ይልቅ የ CD4+ እና CD8+ ቲ ሴሎችን ከፍተኛ አገላለጽ ያሳያሉ (Legut et al., 2018)። ስለዚህ፣ በCRISPR/Cas9 የሚመነጩ የተሻሻሉ የቲ ሴሎች TNBCን ለማሸነፍ ውጤታማ የሆነ የኢሚውኖቴራፒ ዘዴ ሊሆኑ ይችላሉ።
ኢንቴግሪንስ በሴሉላር ትራንስሜምብሬኖች ውስጥ የሚገኙ እና የሴሎች ከሴሉላር ማትሪክስ (ECM) ጋር ትስስርን የሚያበረታቱ የሴል ማጣበቂያ ሞለኪውሎች ናቸው (ሃሚዲ እና ኢቫስካ፣ 2018)። የኢንቴግሪንስ አለመመጣጠን ከሴሉላር ማትሪክስ ጋር በመቀየር ከካንሰር እድገት እና ፍልሰት ጋር የተቆራኘ ሲሆን ይህም በስርጭቱ ውስጥ የካንሰር ሴል ህልውና እንዲኖር ያደርጋል (ሃሚዲ እና ኢቫስካ፣ 2018)። CRISPR/Cas9-mediated integrin knocking በTNBC ውስጥ የቲሞር እድገትን፣ ሜታስታሲስን እና ቅኝ ግዛትን ያዘገያል። የኢንቴግሪን a5 (ITGA5) ን መዝረፍ እንደ የሳንባ ካንሰር ባሉ ሌሎች ካንሰሮች ውስጥ የሴል ፍልሰትን እና እድገትን እንደሚቀንስ ሪፖርት ተደርጓል (ጁ እና ሌሎች፣ 2017)፣ ይህም ኢንቴግሪን a5 በTNBC በሽታ አምጪነት ውስጥ ቁልፍ ነገር ሊሆን እንደሚችል ይጠቁማል።
በባህላዊ የፅንስ ግንድ (ES) ሴል ዘዴዎች በመጠቀም የknockout አይጦችን ማመንጨት ጉልበት የሚጠይቅ፣ ጊዜ የሚወስድ እና ውጤታማ ያልሆነ ሂደት ነው። የES ሴሎችን በሆሞሎጎስ ሪኮምቢኔሽን በኩል ለማነጣጠር፣ ቺሜሪክ አይጦችን ለማራባት እና ከዚያም በሄትሮዚጎስ አይጦች አማካኝነት ሆሞዚጎስ ዘሮችን ለማምረት ወራት እና ዓመታት ይወስዳል። በርካታ የጄኔቲክ ሚውቴሽን ያላቸው አይጦችን ለመፍጠር ውስብስብ የሆነ የመራባት ሂደት ያስፈልጋል። ሆኖም፣ CRISPR/Cas9 ን በመጠቀም የES ሴሎችን በማጥፋት ወይም የCRISPR/Cas9 ክፍሎችን ወደ ነጠላ-ሴል የተዳቀሉ እንቁላሎች ማይክሮ ኢንጅ በማድረግ የሚፈጠሩ አይጦችን ሲጠቀሙ ብዙ ችግሮች ተከስተዋል። ለምሳሌ፣ የለውጦች መግቢያ ብዙውን ጊዜ በቢያሌሊክ ሎሲ ይከሰታል እና በጂን የተለየ አይደለም። በቅርቡ CRISPR/Cas9 ቴክኖሎጂን የሚጠቀሙ የES ሴሎች በአንድ ጊዜ እስከ 5 ጂኖች ውስጥ የቢያሌሊክ ሚውቴሽን ማስገባት እንደሚችሉ ተዘግቧል (ኒሺዞኖ እና ሌሎች፣ 2021)። ለዚህ ዓላማ፣ Cas9 mRNA እና አምስት ጂን-ተኮር gRNAs በአንድ ጊዜ ወደ ES ሴሎች ተላልፈዋል። ይህ የዚህን አሰራር ተስፋ እና ውጤታማነት ያጎላል፣ ምንም እንኳን እነዚህ ሚውቴሽኖች የመስራች መስመሮችን በማዳቀል የአራት እጥፍ የኳንኪ አይጦችን ለማምረት ሲዳብሩ ተላልፈው ሊሆን ይችላል። ጥናቱ አስገራሚ ግኝትንም ዘግቧል፡ የES ሴሎች በጄኔቲክ የተሻሻሉ አይጦችን ለመፍጠር ከእንግዲህ አያስፈልጉም። በምትኩ፣ የተወሰኑ የጂን ምርቶችን ለማስወገድ፣ Cas9 mRNA እና gRNA ወደ ነጠላ-ሴል ደረጃ ሽሎች ተወስደዋል። በዚህም ምክንያት፣ በቲዎሪ ደረጃ በአይጦች ውስጥ የጂን መሰረዝ ውጤቶችን ለማጥናት ጥቅም ላይ ሊውሉ የሚችሉ የኳንኪ መስራች መስመሮች ተፈጥረዋል (Qin et al., 2016)። ስለዚህ፣ CRISPR/Cas9 ትራንስጀኒክ አይጦችን ከባህላዊ የጄኔቲክ ምህንድስና በዝቅተኛ ዋጋ TNBCን ለማከም እንዲፈጥሩ ያስችላቸዋል። የCRISPR/Cas ስርዓትን በመጠቀም፣ በTNBC ውስጥ በአንድ ወይም ከዚያ በላይ በሆኑ ውስጣዊ ጂኖች ውስጥ የነጥብ ሚውቴሽን በተሳካ ሁኔታ ሊያስተዋውቅ የሚችል አዲስ የኳንኪ አይጥ ሞዴል ተዘጋጅቷል። በዚህ ጽንሰ-ሀሳብ ላይ በመመስረት፣ የTNBC የእንስሳት ሞዴሎች በCRISPR/Cas9-mediated የBRCA1 እና p53 ስረዛን በመጠቀም ሊዘጋጁ ይችላሉ፣ ይህም የHR ጥገና፣ የጂኖሚክ አለመረጋጋት እና የተለዋዋጭ ፊኖታይፖች መጥፋትን ያስከትላል (አኑዚያቶ እና ሌሎች፣ 2020)።
በአሁኑ ጊዜ እንደ ማሞግራፊ፣ ማግኔቲክ ሬዞናንስ ኢሜጂንግ (ኤምአርአይ) እና አልትራሳውንድ ያሉ የተለያዩ ዘዴዎች TNBCን ለመመርመር ጥቅም ላይ ይውላሉ። ሆኖም ግን፣ እነዚህ ዘዴዎች የተወሰኑ ገደቦች አሏቸው። ማሞግራፊ የካንሰር ሴሎች ወደ ሌሎች የአካል ክፍሎች የተዛወሩባቸውን ሜታስታሲስ ሳይሆን የአካባቢውን የጡት ሕብረ ሕዋስ ለመመርመር ያገለግላል። አልትራሳውንድ ቲቢን ለመመርመር አስተማማኝ ዘዴ አይደለም (ቼን እና ሊ-ፌልከር፣ 2023)። ኤምአርአይ ከአልትራሳውንድ እና ከማሞግራፊ የበለጠ ስሜታዊነት አለው፣ ነገር ግን የምርመራው ትክክለኛነት ውስን ነው (ሻ እና ቼን፣ 2022)። የቲሹ ባዮፕሲ የካንሰር ሴሎችን ለመለየት ወራሪ መንገድ ነው። ሆኖም፣ በአንዳንድ ሁኔታዎች፣ መርፌው ከፍላጎት ቦታው ርቆ ከሄደ ባዮፕሲ የካንሰር ሕብረ ሕዋስ ሊያመልጥ ይችላል። በተጨማሪም፣ በጣም ውድ ነው እና ለታካሚው አሰቃቂ ሊሆን ይችላል። TNBC የተለያዩ የካንሰር ዓይነቶች ናቸው፣ ስለዚህ ባዮፕሲ ስለ ካንሰር አይነት በቂ መረጃ ላያቀርብ ይችላል። ስለዚህ፣ TNBCን ለመለየት አዲስ በምርመራ አስተማማኝ ዘዴ በአስቸኳይ ያስፈልጋል። CRISPR/Cas9 ለጡት ካንሰር ምርመራ በጣም ስሜታዊ እና በትንሹ ወራሪ አማራጭ ሆኖ ሊያገለግል ይችላል። ለዚህም ሲባል፣ የCRISPR/Cas9-ተኮር ስልቶች የTNBC ምርመራን ለማሻሻል PCR ዘዴዎችን ለማሻሻል ሊያገለግሉ ይችላሉ። በመጀመሪያ፣ የCRISPR ስርዓት Cas9 እና cpf1 ፕሮቲኖች ልዩ ያልሆነ ዲኤንኤ ለማስወገድ ያገለግላሉ፣ ከዚያም እነዚህ ሁለት ፕሮቲኖች (Cas9 እና cpf1) ከዒላማው ዲኤንኤ ጋር ከመገናኘታቸው በፊት የPAM ቅደም ተከተልን ሊያውቁ ይችላሉ (Deepak Singh et al., 2021)። ስለዚህ፣ PCR ከካንሰር እድገት ጋር የተያያዙ ሚውቴሽኖችን መለየት ይችላል። በርካታ ጥናቶች በተለያዩ ካንሰሮች ውስጥ የተለያዩ ሚውቴሽኖችን ለመለየት ይህንን CRISPR ላይ የተመሠረተ ስትራቴጂ ተቀብለዋል (Safari et al., 2019)። ስለዚህ፣ በCRISPR ላይ የተመሰረቱ PCR ዘዴዎች የTNBC ምርመራን እንደ ባዮፕሲ-ተኮር ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ ባሉ ወራሪ ዘዴዎች ላይ ያለውን ጥገኝነት ሊቀንስ ይችላል።
በTNBC (TNBC) ውስጥ በሆርሞን ተቀባይ መቆጣጠሪያ ደንብ ላይ የተደረጉ የጂኖታይፕ ለውጦችም ታይተዋል (ቼን እና ራስሶ፣ 2009)። ለክትትል ነጥብ ምርመራ ማይክሮአሬይዎችን የሚጠቀሙ የCRISPR/Cas9-based PCR ስልቶች እነዚህን ሚውቴሽኖች በብቃት መከታተል ይችላሉ (ሃጂያን እና ሌሎች፣ 2019)። እንዲሁም የጤና እንክብካቤ አቅራቢዎች በTNBC ታካሚዎች ላይ ስለሚገኙ የተወሰኑ ሚውቴሽኖች ተገቢ መረጃ ሊሰጣቸው ይችላል፣ ይህም የሕክምና ኮርሳቸውን ለማሻሻል ይረዳል። ሆኖም፣ ይህ የተጣመረ ዘዴ ውስንነቶች አሉት። ስለዚህ፣ ይህ የCRISPR/Cas-PCR ዘዴ ለTNBC ምርመራ በጤና እንክብካቤ ውስጥ ጥቅም ላይ ከመዋሉ በፊት ሰፊ የምርምር ጥረቶች ያስፈልጋሉ (ያንግ እና ሌሎች፣ 2019)።